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哺乳动物细胞表面展示全长类风湿关节炎抗体库的构建
目的 采用哺乳动物细胞表面展示技术构建全长人源类风湿关节炎抗体库.方法 分离类风湿关节炎患者的外周血淋巴细胞,提取总RNA,采用RT-PCR的方法扩增抗体全长轻链基因和重链可变区基因,分别插入哺乳动物细胞表达载体pDGB-HC-TM,电击转化感受态大肠杆菌TOPO- 10,分别构建抗体轻链基因库和抗体重链基因库,然后将抗体轻链、重链基因库联合转染293T细胞,用流式细胞仪分析全长人源抗体在293T细胞表面的表达.结果 成功构建了类风湿关节炎患者来源的IgGl -Kappa型抗体基因库,随机挑选单克隆经DNA序列分析显示轻链库、重链库的序列正确率分别为80％和60％,可表达的抗体库多样性为6.13×1010.结论 类风湿关节炎抗体基因库转染293T细胞后能够在细胞表面表达全长人源抗体,所展示的抗体库具有良好的多样性,能够为下一步筛选特异性抗体奠定基础.
关键词： 哺乳动物细胞表面展示 类风湿关节炎 抗体基因库 全长人源抗体 流式细胞仪 -
采用哺乳动物细胞表面展示技术构建全长人源抗肾癌抗体基因库
目的 采用哺乳动物细胞表面展示技术构建全长人源抗肾癌抗体基因库.方法 分离肾癌患者的外周血淋巴细胞(PBMC),提取PBMC的总RNA,采用RT-PCR的方法 扩增抗体全长Kappa型轻链(LCκ)和重链可变区(VH)基因,分别插入载体pDGB-HC-TM,电击转化感受态大肠杆菌TOP010,构建轻、重链抗体基因库,然后将轻、重链抗体基因库联合转染293T细胞,流式细胞仪分析全长人源抗体在293T细胞表面的表达.结果 成功构建IgG1-Kappa型抗肾癌抗体基因库,随机挑选的克隆经DNA序列分析显示轻、重链库的序列正确性达90%(9/10)和80%(8/10),流式细胞仪分析显示来自轻、重链库的上述克隆各有7个可检测到相应基因在293T细胞表面的表达,可表达抗体库库容量高达7.5×1010.结论 IgG1-Kappa型抗肾癌抗体基因库转染293T细胞后能够在细胞表面表达全长人源抗体,抗体的多样性为下一步筛选特异性抗体奠定良好的基础.
关键词： 哺乳动物细胞表面展示 肾癌 抗体基因库 全长人源抗体 流式细胞仪 -
用导向选择链更替技术建立抗肝癌抗原HAb18G的人源性Fab基因库
目的:在嵌合HAb18-Fab抗体的基础上,利用载体pComb3X,采用导向选择链更替技术建立全人源性Fab基因库.方法:用RT-PCR自肝癌患者外周血单个核细胞(PBMC)中,扩增全套人抗体Fd基因片段和L链基因.首先,将Fd基因克隆入已含嵌合L链基因的展示载体pComb3X/CL中,建立人-鼠杂合的Fab基因库,以原核表达的非融合HAb18G的胞外区片段为抗原,筛选杂合的Fab基因,以得到人Fd基因.然后应用筛选出的Fd基因与人L链基因库配对,建立全为人Fab的基因库,并筛选全人Fab基因.将IPTG诱导的表达菌裂解,取其上清对pⅢ-Fab融合蛋白的功能进行分析,并对其编码基因进行测序.结果:建立了库容为2×107的杂合Fab基因库,经6轮筛选后得到7株杂合Fab基因.利用筛选的人Fd基因建立了库容为0.8×107的全人Fab基因库,经4轮筛选得到2株亲和力较高、特异性强的人Fab基因.测序结果显示,2株Fab基因具有相同的Fd基因序列,与亲本抗体同属IgG2亚类;L链基因为κ型,可变区均属于Vκ3家族.结论:利用导向选择链更替技术,筛选出特异性较强、完全人源化的抗肝癌抗原HAb18G的Fab抗体,为进一步的工作打下了基础.
