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用导向选择链更替技术建立抗肝癌抗原HAb18G的人源性Fab基因库
目的:在嵌合HAb18-Fab抗体的基础上,利用载体pComb3X,采用导向选择链更替技术建立全人源性Fab基因库.方法:用RT-PCR自肝癌患者外周血单个核细胞(PBMC)中,扩增全套人抗体Fd基因片段和L链基因.首先,将Fd基因克隆入已含嵌合L链基因的展示载体pComb3X/CL中,建立人-鼠杂合的Fab基因库,以原核表达的非融合HAb18G的胞外区片段为抗原,筛选杂合的Fab基因,以得到人Fd基因.然后应用筛选出的Fd基因与人L链基因库配对,建立全为人Fab的基因库,并筛选全人Fab基因.将IPTG诱导的表达菌裂解,取其上清对pⅢ-Fab融合蛋白的功能进行分析,并对其编码基因进行测序.结果:建立了库容为2×107的杂合Fab基因库,经6轮筛选后得到7株杂合Fab基因.利用筛选的人Fd基因建立了库容为0.8×107的全人Fab基因库,经4轮筛选得到2株亲和力较高、特异性强的人Fab基因.测序结果显示,2株Fab基因具有相同的Fd基因序列,与亲本抗体同属IgG2亚类;L链基因为κ型,可变区均属于Vκ3家族.结论:利用导向选择链更替技术,筛选出特异性较强、完全人源化的抗肝癌抗原HAb18G的Fab抗体,为进一步的工作打下了基础.
