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SARS冠状病毒M基因膜内区的克隆、表达与鉴定
目的 对SARS冠状病毒M蛋白膜内部分(Mc蛋白)的基因(Mc区)进行克隆、表达及鉴定.方法 采用PCR技术从SARS-CoV GD322株M基因全长片段上扩增得到Mc区,克隆至pGEM-T载体.利用引物上的EcoRⅠ/XhoⅠ酶切位点切下Mc区插入至pET-32a(+)表达载体,转化原核表达系统BL21,表达His-融合蛋白,利用SDS-PAGE和Western-blot对表达产物进行鉴定.结果 扩增的Mc区长度为360 bp,重组子经PCR,双酶切和测序鉴定,获得pET-32a(+)/Mc原核表达菌株并可进行高效表达,表达产物经SDS-PAGE和Western-blot验证为相对分子质量约43 000的融合蛋白,与预期理论值相符.结论 实现了Mc蛋白的高效表达,为进一步研究SARS冠状病毒Mc蛋白的生物学作用奠定了基础.
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SARS冠状病毒Mc区克隆及序列分析
目的:构建SARS冠状病毒(SARS-CoV)GD322株M基因膜内区(Mc区)重组表达质粒,并对目的序列进行序列分析.方法:根据GenBank中公布的SARS-CoV Tor2株M基因序列,设计一对引物,采用RT-PCR法从SARS-CoV GD322株基因组中扩增Mc区,克隆至pET-32a(+)载体中,转化大肠杆菌BL21后测序,利用Clustal X分析所测序列翻译的氨基酸与81株SARS-CoV Mc区翻译的氨基酸序列的差异.结果:测序结果表明该区与Tor2株对应核苷酸序列同源性为100%.与已收集的81株SARS-CoV Mc区所译氨基酸(Mc蛋白)相比,与77株(占95.1%)Mc蛋白完全同源,与4株(占4.9%)仅有一个氨基酸改变.结论:本试验成功构建SARS-CoV Mc区重组表达质粒;SARS-CoV各毒株间Mc蛋白氨基酸序列差异极小,提示利用任一毒株Mc蛋白制备单抗和疫苗具有普遍意义.
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SARS冠状病毒Mc区原核表达及包涵体复性的研究
构建SARS冠状病毒M蛋白膜内区(Mc蛋白)基因(Mc区)融合表达载体,表达并复性该蛋白.克隆Mc区,构建融合表达载体pET-32a(+)/Mc,融合表达Mc蛋白.纯化表达蛋白,采用逐步透析、降低蛋白浓度、加入氧化还原剂复性融合蛋白.用复性蛋白免疫兔产生抗血清,复性蛋白与SARS患者血清和健康人血清反应鉴定复性结果.结果显示,复性蛋白免疫家兔后产生抗血清,该复性蛋白与SARS患者血清特异结合,表明已成功复性该表达蛋白.为SARS疫苗和诊断试剂的研制奠定基础.
