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关于三维共培养体系中血管化的研究
目的 探讨人脐静脉内皮细胞(hUVECs)与人骨髓间充质干细胞(BMSCs)在三维共培养体系中成类血管网状结构的可行性.方法 分别用绿色荧光蛋白和红色荧光蛋白转染第4代hUVECs和第4代人骨髓间充质干细胞,将标记后的细胞植入Ⅰ型鼠尾胶原于培养皿内共培养.添加含有体积分数为5％胎牛血清的内皮细胞培养基(ECM)1 ml.共培养2、4、7 d及单纯细胞培养7 d后用激光扫描共聚焦显微镜观察两种细胞相互成网的状态及其两者生长情况.通过MetaXpress软件系统中血管生成分析模块(Angiogenesis)计算出生成的类血管网状结构的长度值,并利用DNA萃取法分析细胞的活力与增殖水平,反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测与Western blot分析血管内皮生长因子(VEGF) mRNA水平及VEGF蛋白水平.结果 共培养2d后BMSCs明显开始拉伸,呈长梭状,细胞之间无聚集趋势;hUVECs拉伸情况不明显,仅有少数细胞有轻微拉伸.4d后BMSCs持续拉伸状态并有明显聚集趋势,hUVECs拉伸情况明显并有开始有聚集趋势,但两种细胞之间联系不明显,可见类血管状结构形成.7d后两种细胞均拉伸、聚集,两者相互交错并有管状结构形成.DNA含量测定显示细胞数量在7d内有明显增殖,增殖幅度与单纯培养的凝胶支架差异无统计学意义.共培养后2、4、7d对共培养的材料支架进行RT-PCR检测与Western blot分析,结果显示,相对于2d,4d与7 d VEGF mRNA相对表达量分别增长(2.1±0.1)倍及(5.2±0.2)倍;7d后单纯hUVECs及共培养的VEGF mRNA相对表达量分别为单纯BMSCs培养的(2.4±0.1)倍及(8.8±0.2)倍.结论 被荧光蛋白标记后的hUVECs和BMSCs在Ⅰ型鼠尾胶原内可保持其荧光并存活,两者在此共培养体系中可进行三维生长与自由拉伸.7d后可见其明显的相互作用并形成类血管网状结构.可见使用此共培养体系是有效可行的,并且肯定了hUVECs与BMSCs在形成类血管网状结构中的重要作用.
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Ⅰ型鼠尾胶原三维培养模型对树突状细胞形态及分泌能力的影响
目的:通过构建Ⅰ型鼠尾胶原三维(3D)培养模型,探索细胞外力学微环境对DCs产生的影响.方法:取健康人外周血来源的CD14+单核细胞,利用重组人白介素-4(rhIL-4)和重组人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(rhGM-CSF)共同诱导5d,获得未成熟DCs(imDCs),再利用重组人干扰素-γ(rhIFN-γ)和脂多糖(LPS)诱导imDCs为成熟DCs (mDCs);再利用鼠尾肌腱提取Ⅰ型鼠尾胶原体外培养DCs;FITC-Annexin-Ⅴ和碘化丙啶(PI)标记细胞,检测DCs的凋亡率;酶联免疫吸附测定法检测DC的白细胞介素-12(IL-12)、IL-18和IL-1β的分泌水平.结果:与对照组相比,3D力学环境处理后细胞形态发生改变,细胞早期凋亡率降低,IL-18和IL-1β的分泌能力发生下调(P＜0.05).结论:细胞外3D力学微环境能够调控DCs的免疫功能.
