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RegⅣ基因在结直肠癌细胞系中的mRNA表达及pcDNA-RegⅣ的构建与转染
目的:探讨RegⅣ基因在4种结直肠癌细胞系中的表达水平,构建并转染pcDNA-RegⅣ重组质粒,为阐明RegⅣ基因在结直肠癌发生发展中的作用机制奠定基础.方法:采用RT-PCR方法检测HT-29、Caco-2、Sw480、LoVo细胞系的RegⅣ基因表达水平,将获得目的基因RegⅣ克隆于pcDNA3.1/(-)质粒上,用PCR、酶切进行鉴定后,脂质体转染至低表达甚至不表达RegⅣ的结直癌细胞系,用G418筛选后进行RT-PCR鉴定.结果:HT-29、Caco-2细胞系RegⅣ基因高表达,Sw480细胞系表达较前两者弱,LoVo细胞系RegⅣ阴性表达;构建的重组质粒中含有RegⅣ基因,经pcDNA-RegⅣ转染的LoVo细胞RegⅣ基因呈阳性表达.结论:RegⅣ基因在不同的结直肠癌细胞系中表达水平不同.成功构建和转染了pcDNA-RegⅣ,可使得RegⅣ(-)的LoVo细胞系RegⅣ基因呈阳性表达.
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Reg Ⅳ基因对5-FU干预结直肠癌LoVo细胞增殖、凋亡的影响
目的 观察Reg Ⅳ基因对5-FU干预结直肠癌LoVo细胞增殖、凋亡的影响.方法 构建重组质粒pcDNA3.1-RegⅣ并转染LoVo细胞,RT-PCR和细胞免疫组化检测转染前后细胞中Reg Ⅳ基因的mRNA和蛋白表达.终浓度80 μmol/L的5-FU干预细胞48 h后,MTT检测细胞的增殖活性.平板克隆实验观察细胞的克隆形成能力.FCM检测细胞凋亡.结果 LoVo细胞不表达Reg Ⅳ基因,转染后的LoVo/RegⅣ细胞高表达RegⅣ.5-FU干预后,未转染组(LoVo)和空转质粒组(LoVo/空载)细胞增殖活性、克隆形成能力较RegⅣ转染组(LoVo/RegⅣ)明显降低(P<0.05),细胞凋亡率较RegⅣ转染组明显升高(P<0.05).结论 RegⅣ基因表达可能降低5-FU抑制LoVo细胞的增殖活性及克隆形成能力,并能抑制5-FU诱导LoVo细胞凋亡的作用.Reg Ⅳ基因可能是患者对5-FU化疗产生抗药性的标志及导致临床化疗失败的原因之一.
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RegⅣ基因在大肠癌中抗凋亡作用的体外研究
目的 观察RegⅣ基因在大肠癌细胞系中的表达情况及其体外抗凋亡作用.方法 采用RT-PCR和免疫组织化学染色法检测4种大肠癌细胞系中RegⅣ基因的表达,通过MTT法分析不同浓度的姜黄素对4种大肠癌细胞系(HT-29、Caco2、Sw480和Lovo)的生长抑制作用,应用流式细胞仪评价RegⅣ基因的抗凋亡作用.结果 RegⅣ mRNA在HT-29细胞系高表达,Caco2细胞系较高表达,Sw480细胞系较低表达,Lovo细胞系不表达;RegⅣ蛋白在HT-29细胞胞核和胞质内表达阳性,Lovo细胞胞核和胞质表达阴性,Sw480细胞胞质内表达阳性,Caco2细胞胞质内表达弱阳性.不同浓度的姜黄素对4种细胞系的生长抑制作用强弱依次为Lovo＞Sw480＞Caco2＞HT-29;用20 μmol·L-1的姜黄素处理24 h后,4种细胞系的凋亡率大小依次为Lovo＞Sw480＞Caco2＞HT-29.结论 RegⅣ基因高表达与大肠癌发生可能有关;RegⅣ基因在大肠癌中可能具有抗凋亡作用.
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RegⅣ基因对胰腺癌细胞PANC-1增殖、侵袭、转移能力的影响
目的 探讨RegⅣ基因对胰腺癌细胞PANC-1增殖、侵袭、转移能力的影响.方法 取对数生长期的PANC-1细胞,于孵育箱中培养至70%~80%融合,分别以Puro-P-RegⅣ-shRNA慢病毒载体(P-RegⅣ-shRNA组)以及Puro-shRNA慢病毒空载体(P-NC-shRNA组)感染细胞,并设立不感染组(PANC-1组).48 h后,分别用qRT-PCR法和Western blotting法检测各组RegⅣ mRNA及蛋白的表达.通过CCK-8试验检测细胞增殖情况,利用划痕试验和Transwell小室侵袭试验分别检测细胞的转移和侵袭能力.将10只5周龄的雌性裸鼠随机分成P-RegⅣ-shRNA裸鼠组和P-NC-shRNA裸鼠组,每组5只.取对数生长期的P-RegⅣ-shRNA和P-NC-shRNA组细胞分别注射入上述两组中.自接种日起每天观察肿瘤结节生长情况,6周后处死裸鼠并取出瘤体称重并测量瘤体体积.结果 P-RegⅣ-shRNA组中RegⅣ mRNA和蛋白的表达水平较PANC-1组和P-NC-shRNA组均下降(P均<0.05).P-RegⅣ-shRNA组细胞增殖活力较P-NC-shRNA组和PANC-1组下降(P均<0.05).与PANC-1组、P-NC-shRNA组比较,P-RegⅣ-shRNA组48 h细胞迁移距离缩短,穿膜细胞数减少(P均<0.05).PANC-1组、P-NC-shRNA组各观察指标比较,P均>0.05.与P-NC-shRNA裸鼠组比较,P-RegⅣ-shRNA裸鼠组肿瘤生长速度慢,肿瘤体积小(P均<0.01).结论 下调RegⅣ基因可抑制胰腺癌细胞PANC-1增殖、转移、侵袭.
