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铜绿假单胞菌多表位核酸疫苗的构建及其生物学作用的研究
目的:构建铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa,PA)多表位-MyD88基因疫苗并对其免疫原性进行研究.方法:将PA 外膜蛋白F(OprF)的三个中和性B细胞表位及一个外源通用T细胞表位串联,采用重叠PCR方法合成DNA,并在此序列前插入组织型纤溶酶原(tPA)的信号肽基因,将此获得的片段与MyD88基因分别克隆入pIRES载体构建重组质粒pIRES-tPA-OprF:MyD88,并将该质粒免疫Balb/c小鼠,采用ELISA法测定特异性抗体水平.气管内接种PA,进行肺组织匀浆PA细菌计数.结果:成功构建真核表达质粒pIRES-tPA-OprF:MyD88,用该质粒免疫小鼠,能刺激机体产生高度特异性抗体,气管接种PA后,免疫组小鼠肺匀浆细菌计数明显低于其他对照组.结论:成功构建了重组有MyD88基因的PA表位核酸疫苗,接种小鼠后可诱导特异性免疫应答,产生较好的抗铜绿假单胞菌感染的免疫保护作用.
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铜绿假单胞菌外膜蛋白F原核载体构建、表达条件优化及免疫保护作用研究
目的 构建并鉴定铜绿假单胞菌(PA)外膜蛋白F(OprF)原核表达载体,分析OprF蛋白免疫保护作用,优化OprF蛋白诱导表达条件.方法 通过分子克隆获得OprF蛋白的表达菌株.利用切胶纯化获得OprF蛋白,免疫小鼠,通过PA攻毒实验分析OprF蛋白免疫保护作用.采用正交试验,获得OprF菌株的佳表达条件与培养条件.结果 OprF重组载体双酶切、DNA测序鉴定结果与预测一致.Western blot检测表明抗体能与OprF蛋白结合.OprF蛋白对小鼠保护率达64.29％.OprF菌株佳诱导表达条件为:加IPTG终浓度0.1mmol/L,诱导时菌液OD600值1.0,温度32℃,诱导时间8h;佳培养条件为:转速230 r/min,葡萄糖浓度为0％,装液量50 ml.结论 获得OprF表达菌株佳的表达条件与培养条件;验证OprF蛋白对小鼠PA感染有免疫保护作用.
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铜绿假单胞菌外膜蛋白F与HSV-1VP22融合DNA疫苗的构建与表达
目的:构建铜绿假单胞菌外膜蛋白F与Ⅰ型单纯疱疹病毒(herpes simplex virus 1,HSV-1) VP22融合表达的DNA疫苗,并研究其在真核细胞中的表达情况.方法: 构建重组质粒 pVAX1-OprF、 pVAX1-VP22、 pVAX1-VP22-OprF、 pVAX1-OprF-VP22.原核表达VP22 的碳端蛋白,以电洗脱的方法得到纯化蛋白,免疫BALB/c小鼠,制备VP22蛋白的抗血清,West-ern blot鉴定抗体特异性.后,以脂质体法将重组质粒转染真核细胞,利用Western blot检测其在真核细胞中的表达情况.结果: 成功制备了抗VP22的抗血清,重组质粒在真核细胞中得到了表达.结论: 铜绿假单胞菌OprF与 HSV-1VP22融合表达的重组质粒能够在真核细胞中表达,这为进一步的动物实验打下了基础.
