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突变敏感性分子开关检测线粒体DNA A1555G位点的条件优化
目的 对高保真酶介导的突变敏感性分子开关技术检测线粒体DNA(mtDNA) A1555G位点条件进行优化.方法 利用3'硫代磷酸化修饰的突变型引物和野生型引物作为下游引物,在其上游设计一条公共引物分别构成突变引物对和野生引物对,以构建好的包含mtDNA A1555G位点的突变型质粒和野生型质粒为模板,进行高保真聚合酶介导的双向引物延伸反应,对PCR体系中的退火温度、引物浓度、模板浓度等条件优化,通过凝胶成像系统对其PCR结果进行分析确定佳反应条件.结果 分子开关技术检测mtDNA A1555G位点的佳PCR条件:退火温度为61.0℃,引物浓度为0.6 μmol/L,检测模板浓度为103～106 copies/μL.结论 确定了分子开关技术检测mtDNA A1555G位点的佳反应条件,为该技术在线粒体DNA的突变筛查中的应用提供依据.
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用高保真DNA聚合酶介导的PCR检测β地中海贫血热点突变
目的 用高保真DNA聚合酶介导的PCR检测β地中海贫血基因热点突变.方法 选取已知中国人群β珠蛋白基因CD41-42、IVS-2nt654、TATAbox-28、CD17、CD71-72及CD26热点突变位点为检测靶点,分别设计3'末端与野生型基因位点或突变型基因位点完全配对的引物,并用硫化磷酸修饰,进行高保真DNA聚合酶介导的引物延伸反应.用多重PCR反应体系检测临床已知分别含CD26和TATAbox-28突变热点患者的DNA标本.结果 对野生模板而言,仅有野生型等位基因相关引物有产物产生,而突变型等位基因位点特异性引物无产物产生.反之,使用突变模板,仅突变型等位基因位点相关引物有产物产生,而野生型等位基因位点特异性引物无产物产生.高保真DNA聚合酶介导的多重引物延伸反应筛查含有CD26或TATAbox-28突变的患者DNA标本时显示,突变引物混合物只有相应突变位点的产物产生,而野生引物混合物则有除突变位点以外的其他5个位点的产物产生.结论 建立了基于高保真DNA聚合酶的筛查β地中海贫血基因热点突变的PCR技术.
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SNP敏感性分子开关对神经性耳聋GJB3中C→T突变点的识别
目的利用硫化修饰的碱基特异性引物与高保真DNA聚合酶所构成的对SNP敏感的"开/关"系统识别神经性耳聋GJB3中C→T突变点.方法以非耳聋志愿者染色体DNA为模板,采用配对及三末端不配对的3′硫化修饰引物,使用不同保真度DNA聚合酶进行引物延伸反应.结果该方法仅能使野生型基因相关的引物得以延伸,而耳聋基因相关引物则不能延伸.结论本方法可在单碱基水平对遗传病相关基因进行特异性检测,提示其在单基因遗传病的诊断中具有广阔的应用前景.
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基因突变敏感性分子开关检测β地中海贫血基因突变
目的:采用高保真DNA聚合酶介导的基因突变敏感性分子开关准确、快速检测β地中海贫血.方法:首先提取正常人血液基因组DNA,根据已知β珠蛋白基因热点突变CD41-42、IVS2-654区域序列,分别设计突变序列扩增引物,利用低保真酶进行引物延伸反应,将其PCR产物克隆到pMD19-T载体,得到β地中海贫血常见的两个突变住点的基因突变克隆:CD41-42、IVS2-654,然后以这两个突变位点为检测靶点,分别设计3'末端与野生型基因住点或突变基因位点配对的引物,硫化磷酸修饰3'末端并偶联高保真DNA聚合酶构成的基因突变敏感性分子开关,对含有相应突变的阳性质粒模板及正常人基因组DNA模板进行引物延伸反应,并通过凝胶成像系统对其进行分析.结果:当引物与模板完全配对时,引物被延伸,有PCR产物:当引物与模板不完全配对时,引物不被延伸,无PCR产物.结论:高保真DNA聚合酶介导的基因突变敏感性分子开关能准确、快速筛查β地中海贫血CD41-42、IVS2-654突变,提示其在单基因遗传病的诊断中具有广阔的应用前景.
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聚合酶3′外切活性对3′硫化修饰引物聚合反应的影响
目的探讨硫化修饰的次3′末端不配对引物能否引发高保真DNA聚合酶介导的聚合反应的非成熟性终止,即所谓聚合反应的"关"效应.方法采用配对及非末端不配对的3′硫化修饰引物,研究其对不同保真度DNA聚合酶引物延伸反应的影响.结果非末端不配对的3′硫化修饰引物也能引发高保真DNA聚合酶介导的聚合反应非成熟性终止,而对低保真DNA聚合酶所介导的聚合反应则无明显影响.同时,3′硫化修饰的配对引物对不同保真度DNA聚合酶引物延伸反应均无影响.结论硫化修饰的次3′末端不配对引物与3′末端不配对引物对引物延伸的影响相似,同样能引起高保真DNA聚合酶介导的聚合反应的"关"的效应.显然,在单基因遗传病的诊断及单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,SNP)的高通量分析等方面,硫化修饰的碱基特异性引物与高保真DNA聚合酶所构成的对SNP敏感的"开/关"系统,具有广阔的应用前景.
