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Argonaute蛋白在染色质隔离子形成中的作用
RNA干扰(RNAi)是一保守的沉默机制,可以改变染色质结构发挥沉默效应.其中RISC(RNA-induced silencing complex)和miRNP(microRNA effector ribonucleoprotein)是RNA干扰和microRNA途径发挥沉默效应的关键,其核心成分是Argonaute蛋白.染色质隔离子是真核生物基因组表达基因与非表达基因的边界序列,能促进形成更高级核结构,所形成的DNA功能区可行使不同的转录调控作用.近研究证实Argonaute蛋白影响染色质隔离子的核结构并可能作为核结构的调节者影响基因表达的整体改变.
关键词： Argonaute蛋白 染色质隔离子 RNA干扰 基因表达调控 -
利用染色质隔离子构建人基质金属蛋白酶-12转基因表达载体
目的:在构建巨噬细胞特异表达且带有染色质隔离子的人基质金属蛋白酶-12(hMMP-12)转基因表达栽体的基础上构建hMMP-12转基因兔动物模型.方法:首先通过RT-PCR方法扩增hMMP-12基因,产物亚克隆到pGEM-T栽体,测序后获得pGEM-T-hMMP-12,然后利用pJC13构建带有染色质隔离子和清道夫受体A增强子、启动子和人生长激素尾的亚克隆pJC13-SR,再利用pGEM-T-hMMP-12和pJC13-SR重组质粒,构建巨噬细胞特异性的转基因表达载体pJC13-SR-hMMP-12,后pJC13-SR-hMMP-12表达载体线性化,显微注射家免受精卵制备转基因兔,并进行PCR扩增及Southem Blot转基因效果分析鉴定.结果:(1)通过DNA测序和限制性核酸内切酶酶切鉴定证实,hMMP-12成功克隆到所需表达载体中;(2)转基因后获得仔兔36只,以PCR检测结果计算,转基因总效率为1.4%～3-4%,整合率为20%～50%;以Southern Blot检测结果计算,转基因总效率为0.5%～2.2%,整合率为13%～17%.结论:转基因表达栽体的成功构建,为hMMP-12转基因兔动物模型的构建和研究MMP-12在动脉粥样硬化的形成和发展中的作用机制奠定了基础.
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一种真核生物染色质隔离子筛选方案的初步建立
目的 探讨建立染色质隔离子的正负筛选工具的可行性.方法 合成引物从鸡基因组cHS4区域扩增了1段特异的DNA,将PCR产物克隆到T-载体后测序,验证其对增强子的阻断功能;对pEGFP-N1载体进行一系列改造,评价其正负筛选效果. 结果 成功地获得已知的隔离子片段,初步结果表明该片断能阻断增强子的转录激活作用.将TK基因作为负向筛选标记引入pEGFP-N1载体后获得了改造后的载体,转染COS-7细胞经过G418筛选10d后获得了稳定转染的细胞系,在不同浓度GCV药物作用下细胞杀伤效果有差异. 结论 正负筛选方法被成功地引入到筛选系统,为进一步进行染色质隔离子的筛选与利用奠定了基础.
