您当前的位置：
首页 > 文献资料
所属专业：
TAZ转录因子文献资料
-
pLenti6/V5-DEST-TAZ载体的构建及其对成骨前体细胞MC3T3-E1分化的影响
目的:构建人真核表达的TAZ慢病毒载体pLenti6/V5-DEST-TAZ,转染293FT 细胞获得重组慢病毒颗粒,探讨TAZ对成骨前体细胞MC3T3-E1 分化的调控作用.方法:将已经过测序验证的含有TAZ基因慢病毒入门质粒pENTR(tm)221-TAZ通过LR反应克隆到慢病毒载体pLenti6/V5-DEST中.对重组质粒进行酶切鉴定,并在细胞中验证表达.将该重组载体和其他PackingMix 3 个质粒载体充分混合,用阳离子脂质体转染293FT 细胞,培养和待细胞完全裂解后收集富含TAZ基因的病毒颗粒上清液,取适量上清液感染MC3T3-E1细胞,采用杀稻瘟菌素Blastcidin 筛选,建立稳定过量表达 TAZ 蛋白的 MC3T3-E1/TAZ细胞系.用条件培养基诱导 MC3T3-E1和 MC3T3-E1/TAZ细胞系向成骨细胞定向分化,von Kossa 和茜素红染色观察MC3T3-E1和MC3T3-E1/TAZ细胞的成骨分化.结果:凝胶电泳和测序结果均证明TAZ重组慢病毒载体pLenti6/V5-DEST-TAZ构建正确,并能在细胞中正确表达.与辅助质粒共转包装细胞获得慢病毒颗粒,并成功感染MC3T3-E1细胞.Von Kossa 染色和茜素红染色, MC3T3-E1/TAZ细胞系中生成的磷酸钙比MC3T3-E1细胞系中生成的磷酸钙多.结论:成功构建了人真核表达的质粒载体pLenti6/V5-DEST-TAZ,并能在细胞中正确表达;成功包装了TAZ病毒,并获得过表达TAZ的MC3T3-E1细胞;过表达TAZ促进MC3T3-E1向成骨细胞分化.
