首页 > 文献资料
-
Egr1介导的人截短型凋亡诱导因子表达载体的构建及其在乳腺癌MCF-7细胞中的辐射诱导表达规律
目的:克隆人截短型凋亡诱导因子(AIF) cDNA序列,并构建早期生长反应因子1(Egr1)介导的重组表达载体pcDNA3.1-Egr1-AIF△1-480(pEgr1-AIF△1 -480),观察其在人乳腺癌MCF-7细胞中的辐射诱导表达规律.方法:以人白血病Jurkat细胞mRNA为模板,RT-PCR法扩增获得人AIF△1-480,与pMD18T载体连接后行全自动测序,限制性内切酶切取pMD19T-Egr1中Egr1片段,并利用基因重组技术构建Egr1启动子介导的人AIF△1-480表达质粒pEgr1-AIR1-480.实验分为对照组、pcDNA3.1组、pAIF△1-480组和pEgr1-AIF△1-480组.各组质粒分别转染MCF-7细胞,Western blotting法检测AIF及AIF△1 -480蛋白的辐射诱导表达时程-效应(2.0 Gy照射后0、2、4、12、24和48 h)和剂量-效应(0、0.2、0.5、1.0、2.0、5.0 Gy照射后24 h)规律.结果:经测序证实,RT-PCR获得的人AIF△1-480基因与预期一致,pEgr1-AIF△1-480经PCR和酶切鉴定完全正确;各组MCF-7细胞经2.0 Gy照射后0～48 h,AIF蛋白在各组中均有表达,从4h开始显著增加,4、12、24和48 h各组AIF表达与0h组比较差异有统计学意义(P＜0.05),48 h达到大;而在pAIF△1-480和pEgr1-AIF△1-480组,AIF△1-480从2h开始表达,4、12、28和48 h各组AIF△1-480表达与2h比较差异有统计学意义(P＜0.05),24 h达到峰值;而且24和48 h时pEgr1-AIF△1-480组AIF△1-480表达较pAIF△△1-480组显著增加(P＜0.05).各组MCF-7细胞经0～5.0 Gy照射后24 h,各组均有AIF蛋白表达,而AIF△1-480只在pAIF△1-480和pEgr1-AIF△1-480组表达,二者均随着剂量增加而增加,0.2、0.5、1.0、2.0和5.0 Gy照射后各组AIF表达与0 Gy比较差异有统计学意义(P＜0.05),在5.0 Gy照射时达到大,相同照射剂量pEgr1-AIF△1-480组AIF△1-480表达高于pAIF△1-480组.结论:成功构建Egr1介导的人截短型AIF重组表达载体pEgr1-AIF△1-480,AIF和AIF△1 -480蛋白在MCF-7细胞中的表达随照射时间延长和照射剂量增加而增加.
-
电离辐射对转染pcDNA3.1-Egr-1-AIF△1-480质粒的MCF-7细胞增殖和侵袭能力的影响
目的：探讨辐射增强靶向截短型凋亡诱导因子（AIFΔ1-480）对 MCF-7细胞增殖和侵袭能力的影响，阐明其提高肿瘤基因-放射治疗的可能性。方法：人乳腺癌 MCF-7细胞经质粒转染早期生长反应1（Egr-1）介导的AIFΔ1-480重组表达载体 pcDNA3.1-Egr-1-AIFΔ1-480（pE-AIFΔ1-480），2 Gy X射线照射后24 h，分别采用 MTT法和Transwell侵袭实验检测细胞增殖和侵袭能力。实验分为正常对照组、pcDNA3.1组（只转染 pcDNA3.1质粒）、pE-AIFΔ1-480组（转染 pE-AIFΔ1-480质粒）、2 Gy X线照射组和 pE-AIFΔ1-480＋2 Gy X线照射组。结果：质粒转染并经2 Gy X线照射后，正常对照组、pcDNA3.1组和 pE-AIFΔ1-480质粒组细胞生长较快，且增殖规律基本一致。与正常对照组比较，2 Gy X线照射组和 pE-AIFΔ1-480＋2 Gy X线照射组细胞增殖能力显著降低（P＜0.05），且以pE-AIFΔ1-480＋2 Gy X线照射组降低更明显，从12 h开始较2 Gy X线照射组明显降低（P＜0.05）。正常对照组、pcDNA3.1组和pE-AIFΔ1-480组穿过基底膜细胞数基本一致，而2 Gy X线照射组和 pE-AIFΔ1-480＋2 Gy 照射组穿过基底膜细胞较正常对照组明显减少（P＜0.05或P＜0.01），并且 pE-AIFΔ1-480＋2 Gy照射组穿过基底膜的细胞数较2 Gy照射组减少更明显（P＜0.01）。结论：AIFΔ1-480和电离辐射均能抑制人乳腺癌 MCF-7细胞增殖和侵袭，二者具有协同作用，并且 Egr-1启动子能增强辐射条件下的抑制效果。
