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PHD2基因原核表达载体的构建及其在大肠埃希菌中的表达
目的 构建PHD2基因原核表达载体pET-43.1b(+)-PHD2,实现Nus-PHD2融合蛋白在大肠埃希菌中的可溶性表达.方法 用Sac Ⅰ酶切pET-43.1b(+)制备线性化载体,设计与线性化载体两端具有至少15个同源序列的特异性引物,以真核重组质粒pCMV6-Entry-EGLN1为模板,PCR法扩增PHD2目的基因.采用In-Fusion技术构建原核表达载体pET-43.1b(+)-PHD2,并将其导入大肠埃希菌BL21(DE3)中诱导表达.用SDS-PAGE和Western blot分析并鉴定表达出的融合蛋白.用Ni-NTA亲和层析法纯化目的蛋白.结果 成功构建了PHD2原核表达载体;SDS-PAGE结果显示融合蛋白以可溶性形式表达;Western blot鉴定表明融合蛋白可以与PHD2单克隆抗体特异性结合.结论 实现了Nus-PHD2融合蛋白在大肠埃希菌中的可溶性表达,为PHD2生物学功能的研究奠定了基础.
关键词： PHD2 In-Fusion技术 Nus·Tag 大肠埃希菌 -
In-Fusion技术构建Ⅰ型钠通道与绿色荧光蛋白融合表达及其突变载体
目的:构建Ⅰ型钠通道(Nav1.1)与绿色荧光蛋白(GFP)融合表达载体及其突变载体.方法:利用In-Fusion技术将SCN1A基因亚克隆到绿色荧光蛋白真核细胞融合表达载体(pAcGFP1-C In-Fusion Ready Linear Vector).PCR扩增SCN1A基因(与线性载体对应两端有15个相同碱基),In-Fusion技术进行融合即得到pCMV-GFP-C-SCN1A.将其转染HEK293T细胞,Western blot检测Nav1.1的表达.定点诱变试剂盒对其进行定点诱变.结果:1.成功构建Nav1.1与GFP融合表达载体pCMV-GFP-C-SCN1A;2.DNA测序表明:在预期位点已经发生突变,SCN1A基因第190位色氨酸密码子(TGG)突变为终止密码子(TGA).结论:Nav1.1与GFP融合表达载体及其突变载体的构建成功,为进一步研究该突变位点导致Nav1.1功能的改变奠定了基础.
关键词： In-Fusion技术 诱变 SCN1A 癫痫 -
In-Fusion技术构建Ⅰ型钠通道与红色荧光蛋白共表达载体及其突变载体
目的:构建Ⅰ型钠通道(NaV1.1)与红色荧光蛋白(DsRed)共表达载体及其突变载体.方法:利用In-Fusion技术将SCN1A基因亚克隆到DsRed真核细胞表达载体(pCMV-IRES-DsRed).限制性内切酶对载体进行酶切并回收线性载体片段,PCR扩增SCN1A基因(与线性载体对应两端有15个相同碱基),In-Fusion技术进行融合即得到pCMV-SCN1A-IRES-DsRed.将其转染HEK293T细胞,Western blot检测NaV1.1的表达.定点诱变试剂盒对其进行定点诱变.结果:成功构建NaV1.1与DsRed共表达载体,SCN1A基因所编码的第1 623位密码子由谷氨酸(Glu)突变为丙氨酸(Ala).结论:NaV1.1与DsRed共表达载体及其突变载体的构建成功,为进一步研究该突变位点导致NaV1.1功能的改变奠定了基础.
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CKIP-1基因过表达慢病毒载体的构建及其在人前列腺增生细胞系BPH-1细胞中的表达
目的:构建酪蛋白激酶2相互作用蛋白1(CKIP-1)基因慢病毒过表达载体,检测其在人前列腺增生细胞系BPH-1中的表达.方法:用In-Fusion技术将CKIP-1基因亚克隆到真核细胞表达载体(pLenti CMV Puro Empty).限制性内切酶对载体进行酶切并回收线性载体片段,PCR扩增CKIP-1基因,In-Fusion技术进行融合得到pLenti CMV-CKIP-1.将构建成功的过表达质粒和慢病毒的两种辅助包装质粒PMD2G、PAPSX2共转染239T细胞,Western blot检测BPH-1细胞中CKIP-1蛋白的表达.结果:测序结果和Western blot检测均证明CKIP-1过表达慢病毒质粒构建成功,且在BPH-1细胞系中成功过表达.结论:成功构建了过表达CKIP-1基因的慢病毒质粒,且筛选到过表达CKIP-1的BPH-1稳转细胞系,为后续的实验奠定基础.
关键词： 酪蛋白激酶2 人前列腺增生细胞 In-Fusion技术 慢病毒载体
