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全自动测序仪PCR产物测序影响因素研究
目的 对影响ABI3500xl全自动测序仪测序过程的因素进行研究,以提高测序的准确度和成功率并降低成本.方法 对PCR反应体系、产物纯化方法进行优化.将BigDye分别稀释8、16和32倍进行测序PCR反应,比较不同的BigDye稀释倍数对PCR产物测序结果的影响;使用CENTRI-SEP柱纯化法、BigDye CleaningBeads磁珠法和乙醇乙酸钠EDTA法对测序PCR产物进行纯化,比较不同纯化方法对测序结果的影响.结果 BigDye稀释8倍和16倍时,PCR反应体系的测序结果正常,而稀释32倍时测序结果出现碱基误读;3种不同的测序PCR产物纯化方法均可得到满意的测序结果.相比之下,CENTRI-SEP Kit纯化方法所需时间短(0.5 h),但是成本较高;乙醇乙酸钠EDTA纯化方法成本低,但耗时较长(2 h);磁珠纯化法所需时间(1 h)和成本介于CENTRI-SEP Kit法和乙醇乙酸钠EDTA法之间,但不适于高通量操作.结论 ABI3500xl全自动测序仪测序过程中,BigDye稀释16倍时所得测序结果准确且成本较低;3种测序PCR产物纯化方法均可得到准确的测序结果,实际工作中应根据操作者具备的实验条件选择适纯化方法,以减少测序时间和成本.
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不同用量BigDye在HBV测序检测中的效果分析
目的:通过减少测序反应中BigDye的用量,以降低DNA测序的检测成本.方法:64份HBV DNA阳性血清随机分成两组(试验组、常规组),两组血清均用DNA测序法进行检测.其中BigDye的用量试验组为1 μL,常规组为2 μL.结果:试验组29份满意,常规组30份满意,P>0.05,两组阳性率相同.结论:测序反应中,BigDye的用量从2 μL减少至1 μL效果仍然满意,这是降低DNA测序成本的有效方法.
