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siRNA沉默AT2受体通过Ang(1-9)-ACE2-AT2通路抑制心脏微血管内皮细胞NO的生成
目的 研究重组人血管紧张素转化酶2(rhAC E2)作用于心脏微血管内皮细胞后对NO产生的影响,采用siRNA沉默AT2受体研究Ang(1-9)-ACE2-AT2通路在这一过程中的作用.方法 体外培养人心脏微血管内皮细胞(CMVEC),分为对照组、Ang Ⅱ组、Ang Ⅱ+rhACE2组、AT2受体抑制剂组和阴性对照siRNA组.Griess试剂法测定细胞培养上清液中NO的含量,RT-PCR检测HUVEC中eNOS mRNA的表达,检测细胞内NO的生成及内皮型一氧化氮合酶(eNOS)活性.Western blot检测磷酸化eNOS的表达.观察rhACE2对Ang Ⅱ作用后CMVEC生成NO、eNOS mRNA、eNOS蛋白表达的影响,同时观察加用AT2受体抑制剂PD123319干预后,rhACE2对磷酸化eNOS蛋白表达的影响.观察siRNA干扰CMVEC中AT2受体蛋白后对eNOS活性、NO的影响.结果 Ang Ⅱ组NO的含量[(3.495±0.362)nmol/L]明显低于对照组[(11.513 ±0.392)nmol/L,P＜0.05];Ang Ⅱ+rhACE2组细胞培养液中NO的含量和磷酸化eNOS表达水平均明显高于Ang Ⅱ组(P＜0.05),而eNOS mR-NA和非磷酸化eNOS蛋白表达水平与Ang Ⅱ组相比无统计学差异(P＞0.05).经AT2通路抑制剂PD123319干预后的AT2受体抑制剂组磷酸化eNOS表达水平明显低于Ang Ⅱ+rhACE2 30 min组(P＜0.05).Western blot检测结果显示转染AT2siRNA组转染48 h AT2受体蛋白表达降低(P＜0.05);与AT2受体抑制剂组和阴性对照siRNA组相比,转染AT2 siRNA组的eNOS活性和NO含量均显著降低.结论 rhACE2作用于人心脏微血管内皮细胞后,eNOS活性增强,NO生成增加,Ang(1-9)-ACE2-AT2信号通路参与这一过程.
