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小RNA技术干扰p21联合环磷酰胺对HepG2细胞增殖及凋亡的影响
目的 探讨小RNA干扰p21表达联合环磷酰胺对HepG2细胞增殖和凋亡的影响及相关作用机制. 方法 将化学合成的针对p21的siRNA序列转染至HepG2细胞,将HepG2细胞分为5组:空白对照组、阴性对照组、RNA抑制组、环磷酰胺组、联合组(RNA抑制+环磷酰胺).采用MTT比色法、流式细胞术和分光光度法分别检测HepG2细胞增殖、细胞凋亡及半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶家族成员caspase-9、caspase-3和caspase-6的活化程度. 结果 p21 siRNA转染后,相对于环磷酰胺单独处理组,联合处理组HepG2细胞增殖率显著降低,而细胞凋亡率则率明显升高(P＜0.01);caspase-9、caspase-3和caspase-6的活化程度显著升高(P＜0.01). 结论 p21靶向RNA抑制作用联合环磷酰胺处理显著促进了HepG2细胞凋亡,p21可作为肝癌基因治疗的后选新靶点.
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针对Fas的RNA抑制对缺血再灌注神经细胞的保护作用
目的 探讨Fas-RNAi对缺血再灌注(I/R)损伤后神经细胞凋亡的保护作用.方法 细胞随机分四组:对照组、模型组、GFP siRNA组、Fas siRNA组.对照组用完全培养液培养,其他三组细胞制作体外(I/R)模型,GFP siRNA组、Fas siRNA于转染24h后造模,造模后6h进行Caspase-3、Fas表达检测,24 h进行细胞凋亡相关检测.结果 (1)Fas、Caspase-3阳性率:模型组模型组的Fas阳性率(37.25±8.37)%、caspase-3阳性率(28.79±6.23)%明显高于对照组(7.21±3.28,8.01±2.31)%,差异有统计学意义(P＜0.01).GFP siRNA组Fas阳性率(14.35±7.31)%、caspase-3阳性率(16.33±4.15)%明显低于模型组,差异有统计学意义(P＜0.01).(2)凋亡率模型组细胞(39.13±10.63)明显高于对照组(2.85±0.43),差异有显著性(P＜0.01).Fas siRNA组(1.70±0.31)明显低于模型组(P＜0.01).结论 针对Fas的8iRNA能有效地抑制I/R损伤后神经细胞凋亡.对神经细胞I/R损伤有一定的保护作用.
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丹参4-羟基苯丙酮酸还原酶基因RNAi表达载体的构建
为研究丹参4-羟基苯丙酮酸还原酶基因(SmHPPR在丹酚酸类化合物生物合成中的作用,构建SmHPPR的RNAi植物表达载体.根据SmHPPR的序列,设计4对含有酶切位点的特异性引物,以丹参无菌苗叶片cDNA为模板,分别扩增两段目的基因的正反向片段(约402 bp和346 bp),经T-载体克隆并测序后,将正反义片段分别插入表达载体pART27的相应位置(正向目的片段插人中间载体pKANNIBAL内含子左侧,反向目的片段插入该载体内含子右侧),构建了含有发夹结构的RNAi植物表达载体pART27-HPPR1sa、pART27-HPPR2sa和阴性对照载体pART27-Intron.利用三亲杂交法,将这3个载体导人到发根农杆菌LBA9402中.酶切鉴定和PCR扩增结果表明RNAi表达载体构建成功并成功导入到发根农杆菌LBA9402中,为下一步研究SmHPPR基因的功能奠定基础.
关键词： 丹参 4-羟基苯丙酮酸还原酶基因 RNA抑制 载体
