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法国梧桐花粉变应原cDNA表达文库的构建和初步鉴定
目的 构建法国梧桐花粉变应原cDNA表达文库并初步鉴定. 方法 利用Trizol法抽提法国梧桐花粉总RNA,经过Oligo(dT)纤维素柱纯化后分离mRNA,反转录合成ds cDNA,连接EcoR Ⅰ接头,末端磷酸化,Xho Ⅰ消化,电泳分离并凝胶回收大于500 bp以上的cDNA片段,与Uni-ZAP XR Vector连接,经过体外包装,感染宿主菌,构建cDNA文库,检测文库容量和重组率,并采用PCR方法对插入的cDNA片段大小进行分析. 结果 成功构建了一个文库容量为3.5×106 pfu/ml,重组率为94％,平均插入片段长度约为0.7 kb的法国梧桐花粉变应原cDNA表达文库. 结论 所建文库容量及插入片段大小合适,适用于筛选目的cDNA,为进一步研究法国梧桐花粉主要变应原基因并制备重组标准化法国梧桐花粉主要变应原疫苗奠定基础.
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法桐花粉主要过敏原基因Pla a1重组表达及鉴定
目的:表达、纯化和鉴定法国梧桐花粉主要变应原基因Platanus acerifolia pollen allergen1(Pla a1).方法:首先根据文献查找并在GenBank获取法国梧桐花粉主要变应原基因序列Pla a1,利用DNAStar软件进行密码子优化;合成全基因;将Pla a1与载体pET-44a连接后转入大肠杆菌Rosetta中进行诱导并优化目的蛋白表达;利用亲和层析法纯化该外源表达蛋白;应用Western blot,利用法桐花粉过敏患者血清鉴定纯化后的目的蛋白的抗原性.结果:成功构建了pET44a-Pla a1阳性质粒;获得了法桐花粉主要变应原重组蛋白Pla a1;对该重组蛋白进行了亲和层析纯化;免疫印记法表明重组蛋白具有一定的抗原性.结论:首次利用密码子优化的方法获得融合Strep Tag Ⅱ的法桐花粉过敏原重组蛋白Pla a1,为制备高纯度变应原、重组低致敏过敏原及变应原核酸疫苗奠定基础.
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法国梧桐花粉变应原Pla a1基因的克隆与原核表达
目的 克隆编码法国梧桐花粉主要变应原(Platanus acerifolia pollen allergen 1)的Pla a1基因,并构建原核表达载体进行表达.方法 采用RT-PCR法从法国梧桐花粉总RNA中扩增Pla a1基因全长cDNA以及不含信号肽的编码区,克隆至pMD18-T载体中进行测序.采用SalⅠ+SphⅠ双酶切,将不含信号肽的编码区定向亚克隆到pQE-30载体,形成原核表达载体pQE-30-Pla a1E,转化大肠杆菌M15菌株,PCR和酶切图谱鉴定为阳性的克隆子采用IPTG诱导表达,采用SDS-PAGE电泳检测蛋白表达结果.结果 通过RT-PCR从法国梧桐花序总cDNA中扩增出了Pla a1基因的全长cDNA,与已报道序列基本一致,但发现该基因在非编码区存在SNP位点,尤其是在起始密码子ATG之前的Oligo A序列存在长度多态性.本研究还克隆了一条与Pla a1高度同源的新基因Pla a1′的大部分编码区序列.以基因组DNA为模板的对比克隆表明,该基因没有内含子.克隆子菌液PCR和质粒酶切图谱鉴定均表明,pQE-30-Pla a1E构建成功.IPTG诱导的含有pQE-30-Pla a1E的大肠杆菌M15菌液表达的具有6×His标签的PLA A1E蛋白,经SDS-PAGE电泳,显示了一条约16kd的条带.结论 发现了法国梧桐花粉主要变应原Pla a1基因的多态性位点,克隆了与其高度同源的另一条新基因Pla a1′的大部分编码区,成功构建了原核表达载体pQE-30-Pla a1E,并在大肠杆菌中获得高效表达,为获得重组纯化Pla a1变应原并用于花粉变应性疾病的诊治奠定了基础.
