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木瓜蛋白酶对鱿鱼肉嫩化的研究
本文利用木瓜蛋白酶对鱿鱼肉进行嫩化研究.以鱿鱼肉的硬度、咀嚼性为评定指标,通过单因素和正交实验优化木瓜蛋白酶嫩化鱿鱼肉的工艺条件.结果显示鱿鱼肉适宜的嫩化条件为:木瓜蛋白酶的浓度0.1%、处理时间为40 min、温度为40℃、pH值为7.0.
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关节腔内注射不同浓度木瓜蛋白酶建立小鼠膝骨关节炎模型的研究
目的：探讨关节腔内注射不同浓度木瓜蛋白酶建立小鼠膝骨关节炎模型的可行性。方法健康10周龄雄性昆明小鼠80只，体重（45±3） g，随机分为2％木瓜蛋白酶组、4％木瓜蛋白酶组、8％木瓜蛋白酶组和对照组。实验第1、3、5天分组行右膝关节腔内注射2％、4％、8％（ w／v）木瓜蛋白酶和0．3mol／LL－半胱氨酸的混合溶液0．25 mL／kg或等量生理盐水。记录小鼠一般情况及右膝关节宽度。所有小鼠首次注射1周后处死，取关节行常规HE染色及甲苯胺蓝染色，镜下观察并评分。结果造模组右膝关节出现肿胀、功能障碍；右膝关节软骨染色变浅、软骨层变薄、基质分解破坏等病理学改变，其严重程度与木瓜蛋白酶浓度呈正相关；对照组无上述改变。结论膝关节腔内注射2％、4％、8％（ w／v）木瓜蛋白酶和0．3mol／L L－半胱氨酸的混合溶液0．25 mL／kg可建立小鼠不同严重程度的膝骨关节炎，周期短、成功率高。
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不同浓度木瓜蛋白酶建立兔膝骨关节炎模型的比较研究
目的:比较不同浓度木瓜蛋白酶建立的兔膝骨关节炎模型,为研究骨关节炎病理及诊疗方法提供数据支持.方法:将60只新西兰大耳白兔随机分为4组,分别在1、3、5d右膝关节腔注射2％(低剂量组)、5％(中剂量组)、10％(高剂量组)(w/v)木瓜蛋白酶和0.03 mol/L的L-半胱氨酸混合溶液0.1 ml/kg(实验组),以及等量生理盐水(对照组).整个实验过程观察兔状态并记录体重和膝关节宽度.首次注射后第2、4、6周将兔分批处死,取股骨髁、胫骨平台及滑膜做大体及组织病理学观察,并进行评分.结果:实验组均出现关节宽度增大、关节软骨变薄、基质分解破坏、滑膜增生等炎症及退行性改变,严重程度随浓度增高而增高,也随时间延长而发展；对照组无上述改变,二者比较差异有统计学意义.结论:兔膝骨关节腔注射2％、5％、10％木瓜蛋白酶和0.03 moL/L L-半胱氨酸混合溶液0.1 ml/kg可制备不同严重程度的骨关节炎模型,周期短,可重复且成功率高.
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尪痹片对骨性关节炎模型动物膝关节组织形态学的影响
目的:观察尪痹片对骨性关节炎模型动物膝关节组织病理损伤的影响.方法:家兔和大鼠模型动物均随机分为6组(假手术组,模型组,阳性药盐酸氨基葡萄糖组和尪痹片高、中、低剂量组).除假手术组外,其余各组均造模,兔注射木瓜蛋白酶造模方式为尪痹片高、中、低剂量组(10.0,5.0,2.5 g·kg-1)和盐酸氨基葡萄糖组(0.26 g·蚝-1),给药体积均选择为4 mL·kg-1,造模40 d后连续灌胃给药33 d;大鼠切除前交叉韧带造模方式为尪痹片高、中、低剂量组(14.0,7.0,3.5 g·kg“)和盐酸氨基葡萄糖组(0.36 g·kg-1),给药体积均为10 mL·kg-1,造模60 d后连续灌胃给药31 d.每天给药1次,假手术组和模型组给予等体积水.给药结束后,观察动物膝关节活动度和膝关节周长,分别取膝关节进行病理检查,按照半定量分级标准进行综合评分和统计.结果:与模型组比较,尪痹片不同剂量组均可明显改善模型家兔膝关节的活动度,显著减少膝关节周长;可明显改善模型大鼠的活动状态;均可明显抑制2种模型动物膝关节滑膜细胞增生和炎性细胞浸润的程度.结论:尪痹片对木瓜蛋白酶注射诱导家兔和前交叉韧带切除诱导大鼠骨关节炎动物膝关节的软骨、滑膜损伤均具有明显改善作用,提示该制剂对骨关节炎具有一定的治疗作用.
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美洲大蠊醇提取物的木瓜蛋白酶酶解工艺
目的:优选木瓜蛋白酶对美洲大蠊醇提取物的酶解工艺.方法:以水解度为指标,通过单因素和正交试验,分别考察酶解温度、酶解时间、pH、加酶量、底物浓度对木瓜蛋白酶酶解美洲大蠊醇提取物的影响.结果:木瓜蛋白酶酶解美洲大蠊醇提取物的佳工艺条件为酶解温度55℃,时间3h,pH 7.0,加酶量8400 U·mg-1,底物浓度0.5％.在此条件下,水解度可达9.87％.酶解后的样品相对分子质量变小,相对分子质量分布变宽.结论:优选方法稳定,操作简便,为进一步研究美洲大蠊提供依据和基础.
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响应面分析法优化酶提取土茯苓多糖工艺
目的 优化酶法提取土茯苓多糖的工艺.方法 通过单因素试验法和响应面分析法,考察佳酶的酶解时间、酶解pH、酶用量对提取土茯苓多糖的影响.结果 木瓜蛋白酶提取多糖效率高,其佳工艺为酶用量0.6％,酶解pH为8,酶解时间150 rin,在此条件下得到的实际多糖提取率为26.31％,与预测值25.71％的相对误差为2.33％.说明采用响应面分析法优化木瓜蛋白酶提取土茯苓多糖的方法可靠.结论 此设计法用于酶法提取土茯苓多糖可行.
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筋骨片对骨性关节炎大鼠模型的影响
目的:观察筋骨片对骨性关节炎(OA)病变发生发展及其修复作用的影响.方法:将4%的木瓜蛋白酶与0.3 mol·L-1的半胱氨酸混悬液注入大鼠膝关节进行造模,分别给予蒸馏水、阳性对照药骨刺宁胶囊以及筋骨片药液灌胃治疗.连续给药4周后处死动物,进行各项指标的测定.结果:筋骨片对模型大鼠膝关节活动范围有明显的改善作用,各剂量组与模型组比较均有显著性差异;筋骨片各剂量组对模型大鼠膝关节滑膜厚度肿胀有抑制作用,能较好缓解OA的炎性症状,对制动后膝关节内滑膜及软骨的病理变化也有显著的改善作用.筋骨片各剂量组还能明显降低滑膜组织中的丙二醛(MDA),减轻细胞损伤程度.结论:筋骨片减轻关节软骨的退变,明显抑制滑膜组织的炎症,减轻细胞的损伤程度,因而对OA具有一定的治疗效果.
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2.122豚鼠结肠平滑肌细胞L型钙通道特性研究
目的全细胞式膜片钳技术研究豚鼠结肠平滑肌细胞的L型钙通道特性,以加深对胃肠动力调控的认识及有利于胃肠动力药物的开发.方法豚鼠,200～400g,木瓜蛋白酶酶消化法分离结肠纵肌细胞.全细胞膜片钳法记录单细胞的钙通道电流.
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唯酶红细胞抗体的血型血清学特性的研究
本研究的目的是探讨唯酶抗体的血型血清学特性及在临床输血中的意义,为安全输血提供依据.采用含唯酶抗体的病人血清在多种介质中与ABO同型献血者红细胞、谱细胞和自身细胞进行反应,并通过吸收释放试验来判断唯酶抗体的血型血清学特性.结果表明,该唯酶抗体仅在木瓜蛋白酶介质中与献血者红细胞和谱细胞反应呈阳性结果,且自身对照亦呈阳性反应,而在其它介质中均呈阴性反应.吸收实验后抗体效价降低,采用乙醚放散,放散液中未测出抗体.该病人输注ABO及Rh同型献血者红细胞600 ml后无任何不良反应.结论:该例唯酶抗体仅在木瓜蛋白酶介质体外检测中表现出凝集,不会引起溶血性输血反应.
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蛋白激酶C对大鼠小气道平滑肌相关基因表达调控
近年来研究发现肺气肿发生过程中常伴有异常的纤维组织增生,早期以Ⅲ型胶原增加为主[1].我们通过蛋白激酶C(PKC)-抑制因子κB(iκB)信号传导途径的研究来探讨其对木瓜蛋白酶致大鼠肺气肿小气道平滑肌细胞及肺组织α1(Ⅰ)、α1(Ⅲ)前胶原[α 1(Ⅰ)、α1(Ⅲ) PC]mRNA表达的影响.
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木瓜蛋白酶致大鼠肺气肿中碱性成纤维细胞生长因子mRNA的表达
碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）是一种具有促进细胞生长增殖作用的多肽类生长因子，在维持机体的生长发育及促进多种组织的损伤修复中起着十分重要的作用。我们通过对木瓜蛋白酶（Papain）致大鼠肺气肿模型肺组织和肺泡巨噬细胞bFGF mRNA表达的研究，来探讨其在肺气肿形成过程中与肺组织Ⅰ、Ⅲ型胶原增长的关系。 材料与方法（1）肺气肿动物模型的制备与分组：健康Wistar大鼠42只，体重200～250 g，雌雄不拘（由同济医科大学实验动物中心提供），随机分为肺气肿模型1，3，5，7，15，30天组和正常对照组，每组6只。以2%戊巴比妥钠（50 mg/kg）腹腔注射麻醉动物后，实验组气管内注射8%木瓜蛋白酶(美国Sigma公司)0.05 ml/100 g，对照组以同样方法注入相应量的生理盐水。（2）组织细胞标本制作：以2%戊巴比妥钠（50 mg/kg）腹腔注射麻醉大鼠后，行气管插管，向肺内灌注生理盐水，每次5～10 ml，共8次，回收支气管肺泡灌洗液，离心，弃上清，同法用RPMI1640（美国Gibco产品）培养液洗涤细胞1次，用含10%新生小牛血清（Gibco产品）的RPMI1640调细胞浓度至1×106/ml，加入铺有盖玻片的6孔培养板中，置37℃，5% CO2培养箱（Hera Cell德国产）培养24 h后，肺泡巨噬细胞贴壁，取出长有细胞的盖玻片，用4%多聚甲醛固定20～30 min，再用酒精梯度脱水后，置-70℃冰箱保存备用。灌洗肺后取下双肺，向肺内注入4%多聚甲醛，直至肺膨胀边缘变锐、胸膜展平，结扎气管，浸泡于4%多聚甲醛中固定10 h。取左下肺叶常规石蜡包埋、切片、HE染色。（3）免疫组织化学染色：用即用型链酶亲和素-生物素-过氧化物酶复合物(Strept Avidin-Biotin-enzyme Complex，SABC)免疫组织化学染色试剂盒和兔抗鼠collagen Ⅰ及collagen Ⅲ多克隆抗体及DAB显色试剂盒（武汉博士德生物工程有限公司）进行免疫组织化学染色。（4）bFGFmRNA原位杂交：用bFGF寡核苷酸探针和敏感加强型原位杂交检测试剂盒（武汉博士德生物工程有限公司）对组织细胞标本原位杂交。
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应用序惯性二氧化硫、木瓜蛋白酶吸入法建立大鼠实验性肺气肿模型的研究
我们采用序惯性二氧化硫(SO2)、木瓜蛋白酶(PAE)吸入介导复制大鼠肺气肿模型,观察该病病因、发病机制[1].材料与方法 SD大鼠74只(浙江省立同德医院实验动物室),雌雄各半,体重(180±20) g.
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乌司他丁对肝切除病人围手术期免疫功能的影响
乌司他丁(urinary trypsin inhibitor, UTI)是由143个氨基酸组成的糖蛋白,分子量约67000 kD.乌司他丁对胰蛋白酶、糜蛋白酶等丝氨酸蛋白酶,粒细胞弹性蛋白酶、透明质酸酶、巯基酶(木瓜蛋白酶、组织蛋白酶B、H 等)、纤溶酶等多种酶有抑制作用.肝切除作为特殊的重大手术创伤,可引起机体免疫力下降,严重影响病人预后.本文通过临床随机化对照研究,初步评估在肝切除围手术期应用乌司他丁对病人免疫功能的影响.
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关节腔内注射不同蛋白酶建立兔膝骨关节炎模型的对比研究
目的 探讨两种不同蛋白酶诱导的骨关节炎(OA)模型的异同.方法 12只新西兰兔被随机均分为两组,分别经皮右膝关节腔内注入1.6%木瓜蛋白酶0.3 ml (4.8 mg)或Ⅱ型胶原蛋白酶溶液0.5 ml(2 mg)各两次建立模型,末次注射后第6周行右膝放射学及病理学检查.结果 两组模型大体及显微镜病理检查均显示内侧胫骨平台关节软骨呈骨关节炎样退变,其中胶原蛋白酶组的软骨退变程度较木瓜蛋白酶组严重,Mankin评分分别为(10.2±1.9)分及(4.3±1.0)分(t=-4.699, P<0.01),胶原蛋白酶组的关节边缘还可见骨赘形成,而木瓜蛋白酶组无可见骨赘.结论 两种蛋白酶关节腔内注射均可成功建立起骨关节炎动物模型,低剂量的胶原蛋白酶可较稍高剂量的木瓜蛋白酶诱导出更为严重的软骨退变.
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汞和金属离子及多硫化物对木瓜蛋白酶活性的抑制作用
目的 半胱氨酸蛋白酶参与了很多动植物生理过程和病理过程,是Hg2+及其化合物作用的潜在靶点.木瓜蛋白酶是半胱氨酸蛋白酶家族中具代表性、研究为广泛深入的一种蛋白酶,本文以木瓜蛋白酶为模型,研究了汞等金属离子及其化合物对半胱氨酸蛋白酶活性的抑制作用.结果 Hg2+对木瓜蛋白酶活性的抑制能力很强(Ki=2×10-7 mol·L-1).过量的还原型谷胱甘肽和半胱氨酸能够恢复木瓜蛋白酶的活性.多种金属离子(Cu2+、Ag+、Au3+、Zn2+、Cd2+、Fe3+、Mn2+、pb2+、yb3+)对木瓜蛋白酶的活性具有抑制能力,而且抑制能力与金属离子自身的软硬度具有良好的相关性.研究结果表明Hg2+可能作用于木瓜蛋白酶的活性中心.此外,本文首次研究了汞多硫化物复合物对木瓜蛋白酶活性的抑制作用,发现其表观抑制常数(Ki=7×10-6 mol·L-1)与柳硫汞(Ki=2.7×10-6mol·L-1)十分接近,而且其caco-2细胞单层的表观渗透能力(1.9×10-5 cm/s)也较好.结论 汞多硫化物复合物可能通过与半胱氨酸蛋白酶或者其它含巯基蛋白分子作用,发挥生物学活性.本文的研究工作可能有助于阐明汞化合物(特别是朱砂等不溶性汞化合物)的毒理及药理作用的机制.
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一种改进的大鼠皮层神经元原代培养方法及其性质鉴定
目的:对原有大鼠皮层神经元原代培养方法进行改进,以获得数量更多、纯度更高、体外生长时间更长的神经细胞进行相关实验研究.方法:使用3种不同成分的液体对培养器皿进行序贯预处理,分离16～17 d胎龄的Wistar大鼠胎鼠皮层,采用木瓜蛋白酶化学消化与机械吹打相结合的方法制备单细胞悬液,经细胞计数后按照不同实验目的进行梯度密度接种.细胞接种当日4～6 h将含有血清的接种培养液换为添加B27的Neurobasal无血清培养基,培养第3天(DIV3)用终浓度10μmol/L的阿糖胞苷(cytosine arabinoside,Ara-C)处理24 h抑制胶质细胞增殖,以后每周半量换液1次.用倒置相差显微镜观察细胞形态,利用神经元特异性标志物微管相关蛋白2(microtubule-associated protein 2,MAP2)与细胞核双标记法鉴定培养神经细胞的纯度,并以免疫荧光法检测突触前、后标记物以评估突触形成情况.结果:与单纯多聚赖氨酸预处理培养器皿,胰蛋白酶化学消化法分离细胞及含血清培养基培养的原方法相比,方法改进以后收获的细胞产量明显增加,且消化过程对细胞损伤小,接种后细胞分散均匀,杂质少,纯度高,树突、突触发育正常,可长期存活.结论:该方法简便可行,结果稳定,用该方法培养的大鼠皮层神经元可作为神经元体外培养的良好实验模型.
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木瓜做熟营养少
"木瓜炖雪蛤"、"木瓜炖银耳"等菜经常出现在一些大饭店的菜单上.这些搭配看起来非常有营养,实际上却对木瓜中的维生素、木瓜蛋白酶和齐墩果酸等有益的成分造成了很大的破坏.
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酪蛋白抗凝血肽的制备及其体外抗凝血、溶栓作用研究
目的 研究抗凝血肽的制备、分离方法及其体外抗凝血、溶栓效果.方法 用木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶、中性蛋白酶和碱性蛋白酶对酪蛋白进行4酶混合水解制备抗凝血肽,以固定化凝血酶对抗凝血肽进行萃取,用新西兰兔进行体外抗凝血、溶栓实验.结果 实验确定的抗凝血肽制备条件为酪蛋白质量浓度15％,水解每克酪蛋白的木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶、中性蛋白酶和碱性蛋白酶用量分别为1 500、2 400、1000、1250U,水解温度50℃,pH 7.0,水解时间4h.固定化凝血酶萃取抗凝血肽的初始浓度6ATU/mL,萃取温度30℃,pH 5.0,萃取时间30 min.反萃取温度30℃,pH 7.6,反萃取时间40 min.抗凝血肽经高效体积排阻色谱分析,主要成分分子大小与马尿酰-组氨酰-亮氨酸相当.体外抗凝血时间超72 h,溶栓时间24 h.结论 酪蛋白抗凝血肽主要成分为3肽,体外抗凝血及溶栓实验效果良好.
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豚鼠耳蜗外毛细胞外向钾电流的研究
哺乳动物耳蜗具有超常的敏感性和频率分析能力，这依赖于感觉细胞基底膜的微机械反 应。豚鼠耳蜗外毛细胞底侧膜存在电压依赖性K+通道、 Ca2+激活K+通道和内向 钙通道等。文献报道牛蛙壶腹嵴毛细胞有瞬息 K+电流(IA)，然而豚鼠耳蜗外毛细胞是 否存在IA，迄今未见报道。来自脑干的内侧橄榄耳蜗束传出神经纤维大量分布于外毛细胞 ，调控着外毛细胞的功能，一般认为乙酰胆碱是耳蜗传出神经递质，此外三磷酸腺苷(ATP) 对外毛细胞具有神经递质和神经调质双重作用，那么是否还有其他的递质发挥作用呢?我们 应用全细胞膜片钳技术观察了豚鼠耳蜗外毛细胞底侧膜的外向钾电流及乙酰胆碱和去甲肾上 腺素对Ca2+敏感的外向K+电流(Ik(ca))的影响。1 材料与方法 (1)豚鼠耳蜗外毛细胞的分离 选用耳廓反射正常的杂色豚鼠25只，雌雄不限，体重200～31 0 g。单离外毛细胞的制备参照Ashmore等的方法，将豚鼠迅速断头，取出两侧骨大泡，在人 工外淋巴液中打开听泡，剔除耳蜗骨壳，切下二至顶转耳蜗，放入含木瓜蛋白酶(Papain，0 ．5 g／L)的无钙人工外淋巴液中，在室温20～25℃条件下消化20 min，人工外淋巴液反复 冲洗二次以终止消化。在解剖显微镜下用不锈钢针将基底膜从蜗轴分离，此时单离毛细胞即 坠入液体中，静置20 min细胞贴附于浴槽底的盖玻片上。 (2)溶液及药品 人工外淋巴液(mmol/L)：NaCl 137；KCl 5．4；MgCl2 1．8；CaCl2 1．3；HEPES 5．0；Glucose 5．0。KOH调pH至7．2。 电极内液(mmol／L)：KCl l35；CaCl 2 0．1；HEPES 10；Glucose 10。用KOH调pH至7．3。实验在室温20～25℃进行。Papai n(Wako Pure Chemical lndustries，LTD)，tetraethylammonium(TEA，sigma公司)，4-a minopyridine(4-AP，sigma公司)。
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应用木瓜蛋白酶建立绵羊肺气肿模型
目的:应用木瓜蛋白酶局部气管内滴注法复制绵羊不均一肺气肿模型.方法:绵羊气管内插管,局部肺段滴注木瓜蛋白酶,机械正压通气15min制作肺气肿模型.观察影像学及肺组织病理学改变.结果:11只绵羊成功复制出肺气肿模型,成功率84.6%.CT示气肿肺段肺纹理减少,肺野透过度增加.病理观察光镜示肺泡壁菲薄,胀大,弹力纤维破坏,肺泡融合,符合肺气肿表现.结论:木瓜蛋白酶局部气管内滴注能成功复制绵羊不均一肺气肿模型.
