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人类无精子因子B区及其候选基因的研究进展
越来越多的研究证实人类无精子因子基因微缺失与男性不育密切相关,本文通过回顾近年来人类无精子因子基因相关文献,阐述了其B区的结构功能、基因型与表型关系及其缺失机制,重点从其候选基因:BBM、HSFY、CDY等展开,深入探讨其与精子生成的相关关系,为临床对无精症患者的诊断及遗传咨询提供理论依据.
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去甲基酶JHDM2 A的功能研究概况
JHDM2A是一种组蛋白赖氨酸去甲基酶,可特异性催化甲基化H3K9脱甲基,发挥表观遗传学效应,在雄性生殖细胞和于细胞的分化方面有重要功能.
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基因缺陷对精子发生的影响
男性每20人中就有一位患不育症,男性不育症中至少30%存在基因缺陷.生育基因涉及睾丸发育、精子发生、内分泌和旁分泌的调节.关于精子发生,尤其应关注Yq11区,这里分布着一些精子发生基因.随着ICSI的出现和分子生物学技术的发展,人们发现基因缺陷影响了精子发生,继而引起不育.而ICSI虽为男性不育症的治疗带来了希望,但也可能使这种遗传缺陷传给下一代,因此对基因缺陷的检测并避免传给下一代是迫切要解决的问题.
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AZFc微缺失中不同gr/gr缺失亚型对精子发生的影响
目的 研究Y染色体AZFc部分缺失中不同类型gr/gr微缺失对精子发生的影响.方法 实验组选择少弱精子症患者278例,对照组选择符合卫生部标准的汉族合格的已捐精220例健康男性.所有受试者均采取外周血,抽取DNA,选择Y染色体序列标签点(STS),经多重PCR技术检测AZFc微缺失中的gr/gr缺失,对gr/gr缺失患者进一步检测gr/gr-DAZ1/DAZ2缺失和gr/gr-DAZ3/DAZ4缺失类型,对结果进行统计学分析.结果 实验组中278例患者,检测出gr/gr缺失27例,对照组中检测出gr/gr缺失17例,两组比较,差异无统计学意义;27例少弱精子症患者中gr/gr-DAZ1/DAZ2缺失23例,gr/gr-DAZ3/DAZ4缺失4例;正常精液组17例中gr/gr-DAZ1/DAZ2缺失1例,gr/gr-DAZ3/DAZ4缺失16例,两组相比,具有统计学差异(P＜0.05).结论 汉族人群中AZFc微缺失中不同gr/gr缺失亚型在精子发生中所扮演的角色可能不同,gr/gr-DAZ1/DAZ2缺失可能是精子发生障碍的危险因素之一.
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睾丸移植术后生精功能影响因素的研究进展
影响同种异体睾丸移植术后生精功能的因素较复杂,通常与供睾切取、离体睾丸保存、输精管吻合术、合理应用免疫抑制剂等因素有关.
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化疗时生精功能保护的研究进展
据统计,我国0～14岁儿童癌症发病率为19.0～89.9/10万,随着化疗及综合治疗措施的应用与改进,小儿恶性肿瘤5年生存率已接近70%,因此儿童肿瘤患者的远期生存质量也随之受到了高度重视.现已有研究证实,化疗药物可以导致生精功能降低,严重者甚至不育,此结果已成为影响儿童肿瘤患者远期生存质量的重要因素之一.近年来,为了防止或减少生精功能的损害,采取改变化疗方案以降低化疗药物对生精功能的损害、于化疗开始前取精液冷冻保存供以后进行辅助生殖技术、在化疗期间应用某些药物保护睾丸生精功能等均已有研究报告.
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化疗药物损伤生精功能的机理及保护
随着化疗后无瘤存活率的提高,生存质量的改善越来越引起人们的重视,其中化疗所致生育功能损害问题已成为临床关注的热点.目前研究证实化疗药物可对青春期前及成年男性的生精功能产生损害,导致生育时期精子异常,严重影响生育功能[1].
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FSH预测非梗阻性无精子患者精子发生类型的探讨
目的探讨不同精子发生类型的非梗阻性无精子症患者的FSH水平差异是否有显著性,从而评价FSH水平用于单精子卵泡浆内注射时评估精子发生及成熟情况价值.方法选择160例非梗阻性无精子症患者,测定其性激素水平,按睾丸活检分为三组:唯支持细胞、生精成熟停滞、有精子发生但生精功能低下,比较三组FSH水平.结果三组间唯支持细胞与生精成熟停滞、生精功能低下的FSH差异有显著性意义(P<0.01),生精成熟停滞与生精功能低下的FSH差异无显著性意义.结论 FSH可为非梗阻性无精子患者行单精子卵泡浆内注射前预测精子发生类型提供参考.
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人睾丸特异表达基因PIAS-NY原核表达和多克隆抗体的制备
目的 构建PIAS-NY-pET30a原核表达载体,并诱导其成功表达,经纯化后获得高浓度的可溶性融合蛋白His-PIAS-NY,免疫小鼠获得鼠源性PIAS-NY多克隆抗体.方法 以人精原cDNA文库为模板,通过聚合酶链反应(PCR)扩增PIAS-NY开放阅读框,克隆到pET30a表达载体中,酶切、PCR鉴定构建重组质粒.测序完全正确后将质粒PIAS-NY-pET30a转化到大肠杆菌BL21(DE3)中进行大量扩增,异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达.超声、离心、His-Ni柱亲和层析纯化包涵体蛋白,依次经过不同浓度尿素进行蛋白质复性,获得高浓度的可溶性His-PIAS-NY融合蛋白.分6次BalB/C小鼠腹腔注射乳化纯化蛋白.2个月后小鼠眼球取血,收集血清.结果 成功构建原核表达质粒PIAS-NY-pET30a;利用终浓度1 mmol/L IPTG 37℃诱导4 h,大肠杆菌BL21大量表达融合蛋白His-PIAS-NY,并以包涵体形式存在于菌体中;尿素变性后His-Ni柱纯化融合蛋白,复性后获得高浓度的可溶性蛋白His-PIAS-NY;6次免疫后收获存活小鼠抗血清;酶联免疫吸附测定(ELISA)抗血清滴度达到1:100000;免疫印迹和免疫共沉淀证实PIAS-NY抗血清能特异性识别293T细胞和GC2细胞中PIAS-NY蛋白.结论 成功获得PIAS-NY多克隆抗体,而且具有高反应性和高特异性,PIAS-NY在GC2细胞和293T细胞中表达,并且能够与RUVBL2蛋白发生相互作用.
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精子凋亡检测技术的研究进展
人类睾丸是一种具有高度增殖能力的组织,但成人睾丸中产生的成熟精子的数量要比预计生成的精子数少20%～75%[1].大量研究表明睾丸中生精细胞这种自发性变化是通过凋亡而发生的,凋亡在精子发生的生理病理过程中扮演一个重要的角色[2].细胞凋亡,又称程序性细胞死亡(PCD),是指在体内外因素的诱导下,由基因调控而发生的自主性细胞有序死亡.过去对精子凋亡检测技术研究并不多,主要是方法学的不足,随着技术的发展和研究的深入,精子凋亡检测方法逐渐增多.现就目前精子凋亡检测原理、方法及其临床应用作一综述.
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小鼠精子发生过程中雄激素受体对靶基因Septin 7的表达调控
目的:探讨雄激素受体(AR)对睾丸Sertoli细胞中Septin7基因表达的影响.方法:分别采用实时荧光定量PCR及Western blot,检测睾丸Sertoli细胞AR特异性敲除(S-AR-/y)和野生型小鼠(WT)睾丸Sertoli细胞中SEPTIN 7的表达,并观察雄激素对过表达AR的Sertoli细胞系TM4中SEPTIN 7表达的影响.结果:与WT小鼠相比,S-AR-/y中Septin7 mRNA表达水平升高(P＜0.05);雄激素显著降低TM4中SEPTIN 7表达(P＜0.05).结论:Septin7可能是睾丸Sertoli细胞中AR调控的靶基因.该研究对阐明雄激素及其受体调节精子发生的分子机理具有重要意义.
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六味地黄汤对生精障碍模型大鼠精子及其血清NO的影响
目的:观察六味地黄汤对生精障碍模型大鼠促进生精的作用及其对大鼠血清一氧化氮(NO)的影响.方法:用醋酸棉酚建造Wistar雄性大鼠生精障碍模型后,用分煎和合煎的六味地黄汤灌胃给药治疗,以市售六味地黄丸和甲基睾酮为对照,计数各组精子数量,观察各组精子的活力,测定大鼠血清NO水平.结果:模型组大鼠的精子数量与六味地黄汤分煎组、六味地黄汤合煎组、市售六味地黄丸对照组、西药对照组比较,差异有非常显著性意义(P＜0.01);各治疗组、对照组的精子活力也显著优于模型组.模型组大鼠血清N0水平与各组比较,差异有非常显著性意义(P＜0.01);血清NO水平和精子数量、精子质量基本成正相关.结论:六味地黄汤对生精障碍大鼠有显著的促生精作用,同时可升高大鼠血清NO水平,显著提高大鼠精子的质量.
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mRNA差异显示法筛选小鼠精子发生相关基因
目的筛选小鼠精子发生相关基因.方法应用改良的mRNA差异显示技术对1、2、3、4周龄小鼠睾丸进行了基因表达的差异显示分析,并对差异表达的cDNA片段进行了克隆和测序.结果获得了27个在不同周龄小鼠睾丸组织存在明显表达差异的基因片段,其中3个片段分别与Genbank中已知基因LTBP-3、rjs、P38 MAPK基因高度同源,其余基因片段为无同源序列的新基因片段.结论上述结果表明精子发生是一个多基因参与的过程,筛选出的这些基因可能在精子发生的不同阶段调控着精子发生的全过程.
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Rictor/mTORC2调节小鼠睾丸血睾屏障与精子发生
目的 研究Rictor/mTORC2在睾丸血睾屏障形成、睾丸发育和精子发生中的作用及相关机制.方法 采用Cre-loxP重组酶系统,构建睾丸支持细胞中rictor基因敲除小鼠.比较敲除鼠和对照鼠的生殖器官外观和质量.HE染色观察睾丸和附睾的组织形态.采用流式细胞技术检测生精小管的细胞周期.采用免疫荧光技术检测增殖蛋白(Ki-67)和分离酶蛋白的表达.采用免疫组化和Western blot技术检测血睾屏障相关蛋白表达.结果 相比对照鼠,敲除鼠的睾丸和附睾体积和重量都明显变小(P<0.01);敲除鼠的生精细胞中二倍体细胞显著上升(P<0.01),单倍体细胞显著下降(P<0.01),而四倍体细胞、Ki-67和分离酶蛋白无显著差异;血睾屏障相关蛋白出现严重的位置错乱,而蛋白表达量不受影响.结论 睾丸支持细胞中rictor基因的正常表达,在血睾屏障结构完整性维持和功能发挥以及精子正常发生中起着至关重要作用.
关键词： 血睾屏障 睾丸支持细胞 精子发生 哺乳动物雷帕霉素靶蛋白 Rictor -
小鼠DNAJB13与HK1的相互作用
目的 探讨小鼠DNAJB13与HK1是否具有相互作用.方法 应用双酶切连接方法构建pG EX-4T-1/Dnajb13原核表达载体,测序验证;重组质粒转化感受态细胞DH5α,用IPTG诱导融合蛋白GST-DNAJB13表达,采用SDS-PAGE考马斯亮蓝染色和Western blotting分析蛋白和鉴定;提取小鼠睾丸蛋白,采用GST pull down检测DNAJB13与HK1是否具有相互作用.结果 成功构建pGEX-4T-1-Dnajb13重组质粒,测序结果与标准序列一致;转化重组质粒的大肠杆菌在37℃,IPTG浓度1mmol/L诱导下高效表达融合蛋白;GST pull down检测结果阳性,显示DNAJB13与HK1存在相互作用.结论 在小鼠睾丸中,DNAJB13与HK1存在相互作用,可能参与精子形成和精子运动.
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小鼠生精相关基因pQE/Dnajb13重组载体的构建和蛋白表达
目的：利用分子克隆技术构建重组表达载体pQE/Dnajb13，在大肠埃希菌中高效表达、鉴定并纯化。方法应用RT-PCR技术，以小鼠睾丸cDNA文库为模板扩增Dnajb13基因全长开放阅读框，将其连接到pQE载体后测序鉴定；将重组质粒转入宿主菌E.coli M15，经IPTG诱导表达His/Dnajb13融合蛋白，Ni2+亲和层析纯化融合蛋白，采用SDS-PAGE和Western blotting对融合蛋白进行分析和鉴定。结果成功构建了pQE/Dnajb13重组质粒，测序结果与预期一致；转化重组质粒的E.coli M15经IPTG 37℃诱导4 h后高效表达His/Dnajb13融合蛋白。结论成功进行了pQE/Dnajb13重组质粒的构建和重组蛋白的表达，为Dnajb13基因的功能研究奠定了基础。
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生精细胞培养的现状和展望
精子的产生是一个高度复杂有序的过程,涉及细胞的增殖和分化。本文对生精细胞培养技术的进展作一综述。
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BALB/c鼠自身免疫性睾丸炎动物模型的制作
[目的]探讨BALB/c鼠睾丸炎动物模型的建立方法,观察睾丸炎形成后到生殖功能恢复的时间间隔,以及该动物模型的稳定性.[方法]BALB/c小鼠(10周)背脊皮下注射睾丸混悬液0.1 mL,浓度2×107/mL,1次/周,共4次.同种睾丸混悬液(组1)、同种睾丸混悬液加完全免疫佐剂(组2)、异种睾丸混悬液(组3)、异种睾丸混悬液加完全免疫佐剂(组4)、空白对照(组5).[结果]组3建模成功率80%,第5、8、11周按Johusen评分为5.2±1.44、6.2±0.79、8.1±0.87,组1、2、5评分均在9.0以上,组3生精功能明显降低(P＜0.05).组4小鼠于第2次注射后3～5 d,全部死亡.组3第5周生精上皮细胞减少至2～3层,曲细精管管腔中有稀疏的精子,间质出现水肿,淋巴细胞浸润约10%～25%.第5周组3附睾尾精子浓度为(11.0±6.2)×106,精子存活率(10.73±8.14)%,精子活动率(7.3±6.1)%,明显低于组1、2、5(P＜0.05),于第11周组3恢复至正常水平.睾丸炎生精障碍持续21～28 d.[结论]异种小鼠生殖细胞可诱导建立BALB/c小鼠的EAO模型,模型有一定的持续稳定性,可用于精子发育生物学研究.
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精子顶体相关基因DKKL1在正常人和男性不育患者睾丸组织中的表达差异
目的:研究精子顶体相关基因DKKL1在正常人和男性不育患者睾丸组织中的表达差异.方法:采用RT-PCR和Western Blot方法检测DKKL1基因在人多组织中的表达特征,并比较其在正常人和男性不育患者睾丸组织中的表达差异.采用免疫组化方法分析DKKL1蛋白在正常和男性不育患者睾丸组织中的表达差异.结果:人多组织RT-PCR和Western Blot结果显示DKKL1基因为睾丸组织特异性表达,与正常人睾丸组织比较,DKKL1基因在男性不育患者睾丸组织中表达减弱或消失.免疫组化结果显示DKKL1蛋白主要定位在正常男性睾丸的精母细胞和圆形精子细胞,而在唯支持细胞综合征(SCOS)和隐睾患者睾丸组织中不表达,在各种生精细胞阻滞患者的睾丸中观察到不同的表达特征.结论:DKKL1基因在男性不育患者睾丸组织中对精子发生可能具有重要作用,其表达降低或消失可能是男性不育症发生的重要原因之一.
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FMR1基因敲除对雄性小鼠生殖功能的影响
目的:利用脆性X智力低下1号基因(fragile x mental retardation-1,FMR1)敲除鼠,研究FMR1基因时雄性小鼠精子生成的调节及生殖功能的影响.方法:将雄性FMR1基因敲除鼠(KO)和野生型FVB小鼠(WT)分别与野生型FVB成年母鼠合笼,观察母鼠怀孕率,母鼠产仔数及能生育的雄鼠数量;测定雄鼠血清TTFSH及LH浓度;收集睾丸、附睾组织,时左附睾尾部精子进行计数、活率、形态等分析;右侧常规石蜡包埋,切片、HE染色.结果:KO组母鼠受孕率41.7%低于WT组87.5%(P<0.05),能够生育的KO雄鼠比率41.7%也低于WT组91.7%(P<0.05),与KO组和WT组小鼠交配的雌鼠平均产仔数分别为6.50±2.27和8.22±3.03(P>0.05).两组小鼠血清T,FSH,LH浓度无统计学差异.KO组的睾丸附睾病理切片与WT组比较未见明显异常,其精子活率及各种畸形率与WT小鼠比较均没有统计学差异(P>0.05).结论:可以推测FMR1基因对雄性生殖系统发育有一定的影响,Fmr1基因的缺失降低了雄性小鼠生育率,但对精子生成、畸形率等未见明显影响,其对雄性生殖系统影响机制还有待进一步的实验研究.
关键词： 脆性X智力低下蛋白质 基因敲除 生殖 精子发生
