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PIAS-NY酵母双杂交诱饵载体的构建及其自激活活性分析
目的 构建PIAS-NY(protein inhibitor of activated STAT-NY,PIAS-NY)的诱饵载体,为应用酵母双杂交系统筛选与PIAS-NY相互作用的蛋白建立实验基础.方法 应用PCR法扩增PIAS-NY编码序列的片段,先将其克隆入pGEMT-easy内,经序列测定确认无误后,再将片段亚克隆入pGBKT7载体内,将构建好的诱饵载体pGBKT7-PIAS-NY转化到酵母细胞AH109及Y187中,进行诱饵载体的毒性及自激活活性分析.结果 构建了PIAS-NY的诱饵载体,经过自激活活性的分析发现,该诱饵载体没有自激活活性,同时对两种酵母细胞的生长无毒性作用.结论 成功构建了PIAS-NY的酵母双杂交诱饵表达载体,为进一步筛选与之相互作用的蛋白提供了实验基础.
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人睾丸特异表达基因PIAS-NY原核表达和多克隆抗体的制备
目的 构建PIAS-NY-pET30a原核表达载体,并诱导其成功表达,经纯化后获得高浓度的可溶性融合蛋白His-PIAS-NY,免疫小鼠获得鼠源性PIAS-NY多克隆抗体.方法 以人精原cDNA文库为模板,通过聚合酶链反应(PCR)扩增PIAS-NY开放阅读框,克隆到pET30a表达载体中,酶切、PCR鉴定构建重组质粒.测序完全正确后将质粒PIAS-NY-pET30a转化到大肠杆菌BL21(DE3)中进行大量扩增,异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达.超声、离心、His-Ni柱亲和层析纯化包涵体蛋白,依次经过不同浓度尿素进行蛋白质复性,获得高浓度的可溶性His-PIAS-NY融合蛋白.分6次BalB/C小鼠腹腔注射乳化纯化蛋白.2个月后小鼠眼球取血,收集血清.结果 成功构建原核表达质粒PIAS-NY-pET30a;利用终浓度1 mmol/L IPTG 37℃诱导4 h,大肠杆菌BL21大量表达融合蛋白His-PIAS-NY,并以包涵体形式存在于菌体中;尿素变性后His-Ni柱纯化融合蛋白,复性后获得高浓度的可溶性蛋白His-PIAS-NY;6次免疫后收获存活小鼠抗血清;酶联免疫吸附测定(ELISA)抗血清滴度达到1:100000;免疫印迹和免疫共沉淀证实PIAS-NY抗血清能特异性识别293T细胞和GC2细胞中PIAS-NY蛋白.结论 成功获得PIAS-NY多克隆抗体,而且具有高反应性和高特异性,PIAS-NY在GC2细胞和293T细胞中表达,并且能够与RUVBL2蛋白发生相互作用.
