小鼠睾丸生精新基因SRG4原核表达与纯化

目的:原核表达小鼠睾丸生精新基因SRG4, 并对重组蛋白进行纯化, 为研究SRG4的生物学功能奠定基础.方法:应用RT-PCR从小鼠睾丸中扩增SRG4 C端包含一个Sad1_UNC like domain的587 bp片段, 将PCR产物克隆至pUCm-T载体.随后, cDNA片段亚克隆至带有6个组氨酸标签的原核表达载体PQE-30中, 测序鉴定.将重组质粒PQE-30-SRG4转化大肠杆菌M15, IPTG诱导, 表达产物以Western blot进行鉴定, 并进一步通过Ni-NTA Agarose亲合层析纯化.结果:成功地构建了原核表达质粒PQE-30-SRG4.IPTG诱导4 ～5 h, SRG4融合蛋白表达量达高.Western blot分析证实, IPTG诱导表达的蛋白是SRG4融合蛋白.Ni-NTA Agarose纯化后得到较纯的SRG4融合蛋白.结论:重组质粒PQE-30-SRG4能在大肠杆菌M15中表达, 包含Sad1_UNC like domain的纯化SRG4融合蛋白可用于研究SRG4在精子发生中的生物学功能.

鸡胚精原干细胞转染EGFP获得转基因精子的研究

目的:通过精原干细胞体外转染外源基因获得转基因精子.方法:孵化16 d的鸡胚睾丸,酶消化获取精原干细胞(SSCs),纯化后体外培养和传代扩增,碱性磷酸酶(AKP)活性和胚胎阶段特异性抗原(SSEA-1)免疫荧光鉴定.电穿孔介导EGFP转染SSCs,G418筛选8 d后将阳性SSCs移植入经白消安处理的实验鸡体内.结果:移植后25 d采集实验鸡精液检测,精子密度为3.87(10~(10)/L),表达EGFP的成熟精子比率为4.25%;移植后85 d,精子密度为3.27(10~(11)/L),表达EGFP的成熟精子比率为16.25%.睾丸组织冰冻切片显示,曲精细管中转染后的SSCs定居在曲精细管的基底部,有表达EGFP蛋白生精细胞.收集实验鸡精液,提取DNA进行PCR扩增EGFP基因,经凝胶电泳检测,精液DNA的条带清晰,与目的片段大小一致.结论:鸡胚精原干细胞体外转染EGFP可获得转基因精子,为进一步生产转基因模型动物拓宽了途径.

兔抗小鼠睾丸表达蛋白33(Tex33)多克隆抗体的制备与应用

目的 制备兔抗小鼠睾丸表达蛋白33(Tex33)的多克隆抗体并检测Tex33在小鼠精子发生过程中的表达情况.方法 以成年小鼠睾丸组织cDNA为模板,PCR扩增Tex33基因可读框序列,终将PCR产物插入pET-30a载体,构建pET-30a-Tex33原核表达质粒.将原核表达质粒转化人大肠杆菌E.coli BL21中,异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)诱导表达Tex33蛋白.利用Ni-NTA亲和层析柱纯化蛋白,免疫成年雄性新西兰大白兔,获得Tex33多克隆抗体.ELISA测定多克隆抗体效价,Western blot法及免疫荧光组织化学染色分析多克隆抗体效价及特异性.结果 成功构建了pET-30a-Tex33重组质粒,IPTG诱导下表达出Tex33重组蛋白.ELISA检测多克隆抗体滴度为1:1 000 000,Western blot法分析显示多克隆抗体能识别小鼠睾丸组织中的Tex33蛋白,免疫荧光组织化学染色显示Tex33在成年小鼠睾丸组织的精子细胞及精子均有表达,且定位于精子顶体及尾部.结论 成功制备出高特异性的兔抗小鼠Tex33多克隆抗体并发现Tex33在小鼠睾丸中表达.

一种小鼠睾丸细胞涂片的快速制备方法

目的 建立一种用于免疫荧光实验的小鼠睾丸细胞涂片的快速制备新方法.方法 分别给出生后16、21、28 d和120 d的小鼠腹腔注射秋水仙素,3h后取睾丸组织剔除白膜,分离曲精小管进行剪碎,加入冷PBS重悬细胞,过滤,并用冷PBS洗涤细胞3次,然后低渗处理,后经多聚甲醛固定后铺片.对细胞核进行DAPI染色,并以21 d小鼠睾丸涂片为例进行免疫荧光实验,检测所制备的细胞涂片的质量.结果 所制备的小鼠睾丸细胞涂片经DAPI染色,每张细胞涂片均分布大量生殖细胞,背景清晰,根据细胞核的大小与着色,可初步判断生殖细胞类型;用不同发育阶段小鼠所制备的睾丸细胞涂片,细胞分布类型有很大差异,其中28 d小鼠制备的睾丸细胞涂片中生殖细胞类型多;以21 d小鼠睾丸细胞涂片为例进行免疫荧光实验,红色和绿色荧光标记的目标蛋白在精母细胞中表达清晰,背景干净,说明所制备的细胞涂片适合于免疫荧光检测.结论 成功建立了一种快速制备小鼠睾丸细胞涂片的新方法.

精子形成的调控机制及其进展

精子发生与调控是细胞学复杂的领域.近年来,对于精子形成的调控机制有了新认识,对既往的一些研究和结论提出了异议,其内容集中于雌激素与精子发生的关系、对睾酮与精子发生再认识、精子成熟的相关研究以及与精子形成有关的细胞因子等领域,本文对此进行综述、总结和分析.雄激素与精子发生的关系复杂,睾酮在两种酶的作用下,分别转化成双氢睾酮、雌激素,睾酮、双氢睾酮、雌激素可能对精子发生起到不同的作用.睾酮可能通过生精细胞凋亡途径,造成细胞重排,对精子发生起到调节作用.

在正常精子发生和精子发生受损过程中睾丸CREM激活因子(ACT)的表达及其与CREM表达的相关性

抑制素B:一个新的精子发生标志物

血清抗精子抗体与精液主要参数的关系分析

目的:探讨抗精子抗体(AsAb)与精液主要参数的关系.方法:采用ELISA检测血清抗精子抗体,按WHO标准分析精液各参数.结果:507例男性不育患者共检出AsAb阳性127例,阳性率25.05%,经与精液主要参数相关分析,AsAb阳性组精子活力(a+b)、活率及密度较阴性组低,且两组比较有显著性差异(P值均＜0.05).精液液化时间、畸形率较阴性组高,且两组比较有显著性差异(P值均＜0.05).结论:AsAb能够影响精液的主要参数,导致男性生育力低下或不育.

有生育需求中老年男性精子参数的评价

目的:评价有生育需求中老年男性精子参数的变化.方法:42例50～58岁有生育需求男性的精液标本,按照其既往生育史分组,A组:继发性不育23例,平均年龄52.9±2.2(50～58)岁;B组:原发性不育19例,平均年龄52.7±2.7(50～58)岁.按世界卫生组织手册(WHO,2010)方法,检测患者的精子活动率、前向运动精子率、精子浓度、精子畸形率、畸形精子指数和精子顸体完整率.结果:A组的畸形精子率显著低于B组(P＜0.05),其它精子参数组间无统计学差异(P＞0.05).与WHO手册(2010)的参考值对照,A、B组的精子活动率均数、前向运动精子率均数和B组的正常形态精子率均数低于参考值下限.A组和B组分别有1 1例(47.8％)、5例(26.3％)的精子活动率、前向运动精子率、精子浓度和正常形态精子率达到WHO的参考值范围,但达到WHO参考值的例数比率组间无统计学差异(P＞0.05).结论:50～58岁有生育需求中老年男性的精子参数低下,但存在明显的个体差异.

microRNA在精子发生中的作用

microRNA(miRNA)是一类长约19～25 nt的单链小分子RNA,是非编码RNA家族的重要成员之一.越来越多的证据显示miRNA与精子生成过程关系密切.通过分析不同动物物种间睾丸组织中miRNA的变化,显示其在参与精子形成过程中相关蛋白的合成、腔隙的形成,间接调控精子运动以及维持精子成熟、支持细胞成熟中存在作用;同时随着测序及芯片技术的发展,对正常男性、输精管切除者及不同病理类型非阻塞性无精子症患者的精液或睾丸组织进行相关miRNA检测,发现越来越多与人类生精过程有关的miRNA.

MicroRNA与男性不育研究新进展

近年来,很多研究显示microRNA(miRNA)在睾丸组织中广泛表达,参与调控精子发生过程,并且精浆游离miRNA可能作为男性不育诊断的新指标.miRNA在精子发生中的作用越来越受到人们的重视.本文将从男性不育的现状,miRNA的转录后调控作用,miRNA与精子发生及其调控机制,精浆游离miRNA与男性不育的诊断等方面进行综述.

睾丸支持细胞连接结构在精子发生过程的作用

睾丸支持细胞(Sertoli cell)是曲细精管内唯一与生精细胞直接接触的体细胞,在生精过程中起免疫屏障、支持、营养和调节作用.相邻支持细胞、支持细胞与生精细胞之间的连接类型包括紧密连接、锚定连接和缝隙连接.这些连接结构与精子发生过程紧密联系,连接结构紊乱或异常,会干扰精子发生过程中的信号通路、生精细胞迁移、精子形态形成和精子极性维持等,引起生精功能障碍,导致男性生育力下降,甚至不育.

管周细胞在介导睾丸功能中的作用

管周细胞是分布在生精上皮基膜外,围绕曲细精管呈环形排列的一类肌成纤维细胞,有伸缩和分泌功能.管周细胞合成了多种生物活性物质,旁分泌调节间质细胞和支持细胞的功能.管周细胞的发育依赖于雄激素作用,间质细胞合成雄激素过程被阻断或抗雄激素抗体的出现都能抑制管周细胞的发育.单独雄激素不能促使管周细胞分化,它需要同时有促性腺激素作用于支持细胞,间接地刺激管周细胞分化.管周细胞分泌旁分泌因子PModS等调节支持细胞功能,促进支持细胞合成雄激素合成蛋白和转铁蛋白.管周细胞、间质细胞和支持细胞相互之间密切联系,协调促进精子发生和睾丸雄激素合成.

微小RNA(microRNA)与雄性生殖

作为非编码RNA家族的一类重要成员,目前越来越多的证据显示microRNA(miRNA)分子广泛参与细胞增殖、分化、凋亡、信号转导、器官形成、脂肪代谢、造血、胚胎发育、病毒复制,甚至肿瘤发生等多种细胞生命活动进程的调控.对人与鼠睾丸组织的小RNA克隆文库测序发现了大量表达的miRNA分子,研究显示这些睾丸高丰度或特异表达的miRNAs可能发挥极其重要的对生殖细胞性别决定、自我更新、精原细胞有丝分裂增殖、精母细胞减数分裂以及圆形精子细胞变态等过程的调控作用.

蛋白激酶CK2与精子发生关系的研究进展

CK2是一种在真核细胞中普遍存在的信使非依赖性丝/苏氨酸蛋白激酶,可通过对底物的磷酸化作用,或通过蛋白质的相互作用,影响精子发生过程中的许多关键蛋白,从而调节生殖细胞的分化、发育、释放和凋亡.CK2作为一种新的男性不育候选基因,与精子发生密切相关,为男性不育的临床诊断和治疗提供了又一新的依据和思路.

精子发生相关基因的分子遗传学研究进展

特发性无精、严重少精症的分子遗传学研究越来越广泛深入.近年来,控制精子发生的相关基因,主要包括位于Y染色体AZFa区的USP9Y和DBY、AZFb区的RBM基因、AZFc区的DAZ基因,和位于常染色体的DAZLA基因等在分子遗传学研究方面均取得了可喜的进展.对这方面的研究进展及其展望进行了综述.

SEPT11基因在小鼠睾丸精子发生过程中的表达特征

目的 初步探讨Septin 11 (SEPT11)基因在精子发生中的作用.方法 通过实时定量PCR、蛋白免疫印迹及免疫荧光等方法检测SEPT11在不同周龄野生型小鼠以及成年睾丸支持细胞激素受体(Ar)特异性敲除小鼠(SCARKO)和Ar全敲除(ARKO)小鼠睾丸中的表达特征.结果 SEPT11基因小鼠出生2周内高表达,随后表达水平降低,出生6周后出现并与未释放的成熟精子共定位且高表达.与野生型小鼠相比,SEPTIN 11在SCARKO小鼠和ARKO小鼠睾丸中表达降低(P＜0.01),mRNA水平显著升高(P＜0.01);SEPTIN11在成熟精子中定位于尾部.结论 SEPT11基因在小鼠出生时表达高;SEPTIN11在小鼠成熟精子中定位于尾部;Ar的敲减提高了SEPT11的表达.

锌指蛋白(ZNF)185在小鼠不同发育阶段睾丸中的表达

目的:研究锌指蛋白(ZNF)185在小鼠不同发育阶段睾丸中的表达.方法:从小鼠脑、肝、卵巢和不同发育阶段睾丸组织中提取总RNA,采用半定量RT-PCR法检测ZNF185的表达;制备小鼠不同发育阶段睾丸冰冻切片,应用免疫细胞化学分析法检测ZNF185蛋白的定位.结果:①ZNF185在睾丸中的表达显著高于脑、肝和卵巢组织.②ZNF185在小鼠性成熟前组睾丸中的表达显著低于性成熟期和老年期,而性成熟期和老年期之间差异不显著.③在性成熟前,ZNF185主要定位于睾丸间质细胞和类肌细胞;在性成熟期和老年期小鼠中,ZNF 185主要定位于睾丸间质细胞、类肌细胞和精子.结论:ZNF185在小鼠性成熟后睾丸中的表达升高,定位更广泛.

精子顶体小泡蛋白-1(ACRV1)在小鼠睾丸组织中的表达与定位

目的:研究精子顶体小泡蛋白-1(ACRV 1)在小鼠睾丸组织发育过程中的表达特征.方法:将4 d、9 d、18 d、35 d、54 d和6月龄小鼠睾丸组织cDNA探针与Affymetrix全基因组芯片进行杂交,筛选出差异表达的ACRVI基因.采用RT-PCR方法检测ACRVI基因在小鼠不同日龄和不同组织中的表达情况,采用免疫组织化学方法检测ACRVI蛋白在小鼠睾丸组织中的定位.结果:对Affymetrix全基因组芯片杂交结果分析后,筛选得到1个差异表达杂交点,通过在NCBI网站与小鼠全基因组序列Blast分析可知该差异表达基因是ACRVI基因.RT-PCR结果表明ACRVI mRNA呈小鼠睾丸特异性表达,在出生31d小鼠睾丸开始高表达,在成年前达到高峰.ACRVI蛋白主要定位在睾丸圆形精子和长形精子细胞.结论:ACRVI基因存在发育的表达调控,为小鼠年龄依赖性表达基因,其表达与小鼠精子发生的过程有很强的一致性,且具有睾丸特异性表达的特征,因此推测该基因可能在精子发生中具有关健作用.

uPAR在大鼠睾丸第一精子发生波中的表达变化

目的:探讨uPAR在大鼠精子发生中的作用.方法:取出生后d 0、d 5、d 10、d 15、d 21、d28、d 35、d42、d49、d 56 SD大鼠睾丸组织,采用实时荧光定量分析法检测各年龄组大鼠尿激酶受体(uPAR)mRNA表达,并用Western印迹法检测各年龄组大鼠uPAR蛋白表达.结果:大鼠睾丸组织uPAR mRNA表达与蛋白表达有相似的趋势:刚出生时表达水平较高,后逐渐下降,约在d 15达低,到d 28时开始增加,到d 35时到达高峰,随后d 42下降,之后保持一定的水平.双变量回归相关分析显示,uPAR mRNA表达与蛋白表达为中度正相关.结论:大鼠睾丸uPAR表达在第一精子发生波中出现2个高峰,第一高峰在刚出生时,说明uPAR与精子发生的启动有着密切联系.第二高峰是在出生第5周,这说明uPAR可能参与精子排放过程中的组织重塑及精子变态过程.