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液相芯片分析技术及其临床应用
随着分子生物学技术的不断发展,人们对基因与蛋白的探索和认识逐渐深入,多种新型的高通量检测技术应运而生.液相芯片检测技术又称多功能悬浮点阵,是20世纪90年代中期美国Luminex公司开发的芯片技术.它将流式检测与芯片技术有机地结合在一起,大大延伸了流式的检测平台,以微球体代替细胞作为反应载体,在这个开放的反应体系中可以进行蛋白、核酸等生物大分子的检测.液相芯片具有重复性好、高通量、灵活性好、灵敏度高、操作简便、耗时短、成本较低等优点.在临床应用中具有广阔的前景.本文就液相芯片技术的技术原理、检测方法、发展现状和临床应用做一综述.
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3个肿瘤标志物联合检测液相芯片系统的建立
目的 探讨建立多个肿瘤标志物联合检测的luminex液相芯片检测方法.方法 应用配对好的AFP、血管内皮生长因子(vascular endothelial growth facto,VEGF)、细胞外基质金属蛋白酶诱导因子(extracellular matrix metalloproteinase inducer,EMMPRIN/CD 147)3对单克隆抗体建立3个肿瘤标志物联合检测的luminex液相芯片检测体系并评估其敏感性,交叉反应并将其应用于血浆样本的检测.结果 3对抗体在luminex液相芯片系统中无交叉反应,敏感性分别为AFP 64 pg/ml、CD147 40 pg/ml、VEGF4 pg/ml.应用该体系检测了40例HCC患者,分别为AFP[6.5 (2.8,240.0)]ng/ml,CD147 (4.11 ±0.90) ng/ml,VEGF[40 (20,50)]pg/ml;40例健康对照组,分别为AFP [0.3 (0.1,1.0)]ng/ml,CD147(2.98±0.80)ng/ml,VEGF[10(0,10)]pg/ml.3个肿瘤标志物在肝癌患者外周血中的浓度显著高于正常对照组(P＜0.05).结论 成功建立高敏感性的3个肿瘤标志物联合检测的液相芯片检测体系.
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建立快速检测禽白血病病毒的液相芯片方法
目的 建立快速检测禽白血病病毒(Avian Leukosis Virus,ALV)的液相芯片方法,为大量样品的检测提供技术支撑.方法 制备抗ALV P27单克隆抗体,生物素标记抗体,磁珠偶联捕获抗体,利用Luminex200分析系统验证该方法的特异性、敏感性及重复性.结果 阳性判定标准定为大于或等于空白对照的两倍.特异性检测结果显示与鸡的其他多种病原不存在交叉反应,特异性良好.同时多批次实验结果显示其变异系数在7％以内,说明该方法的稳定性好,可重复.结论 建立的检测ALV病原的液相芯片方法特异性好,稳定且可重复.
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液相芯片技术检测马立克氏病病毒方法的建立
目的 建立检测马立克氏病病毒的双抗夹心液相芯片技术方法.方法 将捕获抗体偶联到19号微球,分别确定捕获抗体的偶联量、检测抗体和SA-PE抗体的工作浓度,用建立的液相芯片方法进行特异性、灵敏度、重复性及临床样品的分析.结果 1×106个荧光编码微球的抗体偶联量为2 μg,佳的检测抗体与SA-PE的工作浓度分别为2 μg/mL和4μg/mL.该方法特异性强,只检出马立克氏病病毒,其他病毒未检出;灵敏度为125 pfu/mL;批内批间的变异系数分别为0.85％和2.4％;对58份临床样品检出率为31％.与PCR方法比较,符合率为94.8％.结论 建立的马立克氏病病毒液相芯片检测方法具有特异性好、灵敏度高、重复性好等优点.该方法可用于马立克氏病的监测,也可用于SPF鸡的筛选.
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转基因小鼠常见传染病血清学液相芯片技术多重检测方法的建立
目的 制备小鼠MHV、LCM、ECT和HANT液相芯片,建立转基因小鼠传染病抗体的xMAP多重检测方法.方法 将荧光微球分别与小鼠MHV、LCM、ECT和HANT蛋白进行偶联,并且对佳蛋白偶联量、检测抗体佳工作浓度和Streptavidin?PE佳工作浓度进行优化,制备小鼠MHV、LCM、ECT和HANT液相芯片,对56个转基因小鼠血清样品、阴性血清、阳性血清和质控血清进行xMAP多重检测.并应用传统的ELISA方法对xMAP检测结果进行验证.结果 1)小鼠MHV、LCM、ECT和HANT蛋白的佳偶联量分别为20μg、20μg、40μg和20μg,检测抗体佳浓度分别为2μg/mL、2μg/mL、2μg/mL和4μg/mL;Streptavidin?PE抗体佳浓度均为2μg/mL;(2)xMAP检测结果显示,14号、23号、55号和56号转基因小鼠血清MHV MFI值和index值均高于质控血清,其余小鼠血清的MFI值和index值均低于质控血清,表明14号、23号、55号和56号转基因小鼠MHV抗体阳性,其余小鼠MHV、LCM、ECT和HANT抗体阴性;(3)ELISA检测结果显示,14号、23号、55号和56号转基因小鼠MHV A450值和index值均高于质控血清,其余小鼠血清的A450值和index值均低于质控血清,表明14号、23号、55号和56号转基因小鼠MHV抗体阳性,其余小鼠MHV、LCM、ECT和HANT抗体阴性,该ELISA检测结果与xMAP检测结果相一致.结论 建立的xMAP多重检测技术可应用于转基因小鼠的传染病检测.
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液相芯片技术在小分子RNA检测分析中的应用
既往,人们一贯认为RNA作为一种相对惰性的生物大分子,除了执行DNA建造蛋白的指令外并无其他作用.近一系列研究表明,小分子RNA(microRNA,miRNA)实际上操纵着许多细胞功能,可通过互补序列的结合反作用于mRNA,从而关闭或调节相关基因的表达,甚至可通过指导基因的开关来调控细胞的发育时钟,在干细胞和肿瘤等前沿研究领域显示出巨大潜能[1].本文拟结合液相芯片检测分析系统,探讨其在miRNA研究中的应用前景.
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同时检测八种HCV亚型的方法研究
目的 建立丙型肝炎病毒八种亚型的液相芯片分型检测方法.方法 通过建立多重PCR扩增、核酸探针偶联及杂交检测方法,建立液相芯片分型检测方法,并评价所建立的方法.结果 建立的基于液相芯片技术的丙型肝炎病毒分型检测方法能对八种亚型进行检测和分型,具有较高的特异性和敏感性.对142份临床样本的检测结果表明,该方法具有高通量、快速、敏感、特异的特点.结论 本研究建立的方法能实现对丙型肝炎病毒八种亚型的同时快速检测,是丙型肝炎病毒分型检测的一种新方法.
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Luminex液相芯片在微生物多重检测中的应用
液相芯片作为一种新的生物芯片技术,以不同荧光编码微球作为反应及信号检测载体,流式细胞术作为光学检测手段,在液相反应体系中实现蛋白质、核酸等多种生物大分子多重检测.它既保持了生物芯片高通量的特性,又具有高速度、低成本、准确性高、重复性好、灵敏度高、线性范围广、无需洗涤、操作简便等优势.该文对此技术的原理、特点及其在疾控机构微生物多重检测中的应用进行综述.
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光子晶体编码液相芯片技术与肿瘤筛查
肿瘤筛查中通常采用多种肿瘤标志物的联合检测以提高诊断率。因此，为了提高筛查效率，亟需一种多元分析技术应用于肿瘤筛查。液相芯片技术是由基因微阵列生物芯片技术演变而来的多元分析技术。它由编码微球、探针分子、目标分子和报告分子四部分组成，可用于目标物的定量分析。微球编码技术是液相芯片技术的研究热点，本文中涉及的光子晶体编码是光学编码策略的一种，具有良好的稳定性和解码性能。长期研究表明，光子晶体编码液相芯片在肿瘤筛查、诊断中应用前景广阔。本文综述了光子晶体编码液相芯片技术的基本原理、技术特点及在肿瘤筛查中的应用现状。
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4种病原抗体液相芯片同步检测方法建立
全球经济化的发展、贸易的开通,交通的便捷,无不为各国旅行、探亲、交易打开了方便之门,人口流动速度加快,与此同时传染病的传播也随之蔓延[1].为保障居民生命健康安全,进行国境口岸传染病病原抗体的快速筛查,为传染病的传入与传出建立一道屏障有重要意义[2].本研究建立针对登革病毒、土拉菌、禽流感病毒、西尼罗病毒4种病原抗体高通量快速筛查的液相芯片检测方法.结果报告如下.
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针刺足三里穴对癫痫大鼠海马组织Leptin、RANTES表达的影响研究
目的:通过针刺足三里穴,观察癫痫大鼠海马组织中细胞因子Leptin、RANTES的表达,以探讨针刺治疗癫痫的作用机制.方法:选用6～8周龄体质量约200 ～ 250 g的SD雄性大鼠30只,随机分为正常空白组、正常足三里组、模型空白组、模型足三里组.采用氯化锂-匹罗卡品癫痫大鼠模型,于造模成功后第2天予以针刺干预,连续10天后取材,运用液相芯片技术检测各组大鼠海马组织中Leptin、RANTES的表达.结果:与正常空白组相比,模型空白组RANTES的表达明显增高,差异有统计学意义(P＜0.05),而Leptin的表达虽有所增加,但差异无统计数意义(P＞0.05),正常足三里组Leptin、RANTES的表达均有所下降,而差异无统计学意义(P＞0.05);与模型空白相比,模型足三里组Leptin、RANTES的表达均有所下降,且差异有统计学意义(P＜0.05);正常足三里组与模型足三里相比,RANTES的表达增加,差异有统计学意义(P＜0.05),而Leptin的表达下降,差异无统计学意义(P＜0.05).结论:针刺足三里穴可通过降低癫痫大鼠海马组织Leptin、RANTES的表达,促进癫痫大鼠机能的恢复,起到抑制癫痫的作用;癫痫状态下,针刺足三里能够促进大鼠海马组织RANTES的特异性表达.
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颅咽管瘤患儿血清IL-6、IL-8、MIP-1α含量变化及其意义探讨
目的:研究颅咽管瘤患儿血清IL-6、IL-8、MIP-1α含量变化及临床意义.方法:应用Luminex 200多功能液相芯片分析仪检测39例颅咽管瘤患儿和54例健康对照儿童血清IL-6、IL-8、MIP-1α浓度.结果:颅咽管瘤组血清IL-6、IL-8、MIP-1α浓度均显著高于健康对照组(均P＜0.01),其中MIP-1α浓度变化为显著.颅咽管瘤复发组血清MIP-1α浓度显著高于初发组(P＜0.05),而IL-6、IL-8浓度两组间比较差异无统计学意义(P＞0.05).根据Spearman等级相关分析,肿瘤组血清IL-6、IL-8、MIP-1α浓度两两之间呈正相关(均P＜0.01).结论:血清IL-6、IL-8和MIP-1α浓度变化与颅咽管瘤发生、发展密切相关,三者可能相互关联,共同调节肿瘤进展.
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金黄色葡萄球菌液相芯片检测方法的建立及应用
目的 建立一种快速检测金黄色葡萄球菌的液相芯片检测方法,并进行初步应用.方法 将金黄色葡萄球菌单克隆抗体(mAb930)与聚苯乙烯微球偶联,结合双抗体夹心技术建立金黄色葡萄球菌液相芯片检测方法,通过L9(34)正交设计试验优化方法的反应条件；对建立的方法进行灵敏度和特异性验证；应用建立的方法检测200份食品样品,并与国家标准检测方法进行比较.结果 所建立的检测方法的佳反应条件为:多克隆抗体工作浓度为1∶100,生物素标记的二抗工作浓度为1∶1 000,链霉亲和素-藻红蛋白的工作浓度为2μg/ml,生物素标记的二抗与SA-PE的反应时间为40 min；建立的方法检测金黄色葡萄球菌的灵敏度可达103 CFU/ml,检测其他常见食源性致病菌无交叉反应；建立的方法与国家标准方法检测200份食品样品的结果基本相符.结论 已建立了一种快速检测食品中金黄色葡萄球菌的液相芯片检测方法,能够应用于实际样品的检测.
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人参皂甙Rd抑制大鼠局灶性脑缺血后趋化因子CXCL1和γ-干扰素的蛋白表达
目的:研究人参皂甙Rd(Cinsenoside-Rd,GS-Rd)在大鼠局灶性脑缺血后对炎症趋化因子CXCL1和Y-干扰素(Interferon-γ,IFN-γ)的影响.方法:将SD大鼠随机分为5组:正常组(n=5),假手术组(n＝5),GS-Rd对照组(n＝5),大脑中动脉栓塞模型(MCAO)组(n=20),MCAO+GS-Rd组(n=20).正常组不做任何处理;假手术组进行大脑中动脉栓塞手术,但不插入栓线;GS-Rd对照组给予腹腔注射10mg/KgGS-Rd,不进行手术;MCAO组(n＝20)和MCAO+GS-Rd组(N=20)进行大脑中动脉栓塞手术,术后2小时拔出栓线,MCAO+GS-Rd组在术前15分钟腹腔注射10mg/KgGS-Rd.在12小时、1天、3天、7天四个时间点分别提取脑组织蛋白,通过液相芯片技术检测CXCLI,IFN-γ含量.结果:正常组,假手术组和GS-Rd对照组组间CXCL1,IFN-γ 含量无统计学差异;与三个对照组相比,MCAO组和MCAO+GS-Rd组中CXCLI,IFN-γ蛋白含量均有明显增加(P＜0.05);而与MCAO组相比,MCAO+GS-Rd组CXCL1,IFN-γ的生成明显减少(P＜0.05).结论:10 mg/KgGS-Rd预处理可有效抑制大鼠短暂性脑缺血后CXCLI,mN-γ的生成;通过抑制炎症反应,GS-Rd可能在神经保护中发挥重要的作用.
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大黄牡丹汤对实验性结肠炎小鼠血清细胞因子的影响
目的:探讨大黄牡丹汤对TNBS诱导的小鼠实验性结肠炎的治疗作用及作用机理.方法:采用三硝基苯磺酸(TNBS)法制作实验性结肠炎小鼠模型,给予大黄牡丹汤治疗,观察小鼠的一般状态和DAI评分、结肠组织学变化.采用Luminex液相芯片系统检测血清中白介素1β、白介素4和肿瘤坏死因子α的含量.结果:大黄牡丹汤对TNBS结肠炎小鼠的一般状况及DAI评分有改善作用、并能缓解结肠局部的炎症,可降低血清中白介素1β和肿瘤坏死因子α的含量的水平.结论:大黄牡丹汤具有一定地防治TNBS所诱导的小鼠结肠炎的作用,其机制可能与抑制白介素1β和肿瘤坏死因子α的分泌有关.
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新城疫液相芯片快速检测方法的建立
目的:建立可检测新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)的液相芯片快速检测技术.方法:用DNAStar软件对GEN-BANK中NDV的NP基因进行序列分析设计NDV特异性探针并标记生物素,利用该探针与荧光编码微球偶联后与抽提的NDV病毒RNA的RT-PCR产物杂交反应,用液相芯片检测仪(Liquichip 200)检测荧光信号建立了NDV快速液相芯片检测方法.结果:检测结果显示,该法具有较好的特异性,不与H5AIV和H9AIV反应;检测灵敏度达到150个EID50;该法与鸡胚病毒分离法检出NDV的符合率达到97.1%.结论:初步建立了检测NDV的液相芯片技术,为进一步搭建NDV全新快速高通量检测平台奠定了基础,也为其他同类病毒的快速高通量检测提供了借鉴和经验.
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促甲状腺激素液相芯片检测法的建立和方法学评价
目的 建立用液相芯片技术测定促甲状腺激素(TSH)的方法,对其方法学和临床应用价值作评价.方法 通过抗TSH的单抗交联单色荧光微球,采用标记有生物素的另一配对抗TSH的单抗以及由藻红蛋白(PE)标记的亲合素组成相应的荧光报告系统,用液相芯片仪Luminex100检测待检标本荧光强度,通过TSH标准浓度绘制出标准TSH浓度荧光强度剂量曲线.用液相芯片技术测定100份临床血清标本的TSH浓度并与拜尔的化学发光法的测定结果做方法学比较.结果 液相芯片技术测定TSH的线性范围为0.3～162 μIU/mL,高、中、低3个浓度的批内精密度为10.00%、6.91%、17.80%.高、中、低3个浓度的回收率为94.3%、96.7%、95.2%.与拜尔的化学发光法的相关系数为0.965(P=8.77×10-57).结论 本研究建立的液相芯片技术在TSH测定中的主要技术指标与拜尔的化学发光法相近,有临床应用价值.
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430例中国非小细胞肺癌患者EGFR、KRAS、BRAF和PIK3CA基因突变状态及其临床意义
目的:探讨非小细胞肺癌(non-small cell lung cancers,NSCLC)患者表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)信号通路中EGFR、Kirsten鼠肉瘤病毒癌基因(Kirsten rat sarcoma viral oncogene homolog,KRAS)、B-Raf原癌基因丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶(B-Raf proto oncogene serine/threonine protein kinase,BRAF)和磷脂酰肌醇-3-激酶α亚单位(phosphatidylinositol-4,5bisphosphate 3-kinase catalytic subunit alpha,PI3KCA)基因的突变状态及其临床意义,为酪氨酸酶抑制剂(tyrasin kimase inhibitor,TKI)临床用药与科学研究提供依据.方法:采用SurPlex-xTAG70plex液相芯片技术平台检测中国430例NSCLC患者的福尔马林固定石蜡包埋(formalin fixed paraffin embedded,FFPE)组织中EGFR、KRAS、BRAF和PIK3CA基因的突变状态,分析基因的突变率及其与临床病理特征的关系.结果:EGFR、KRAS、BRAF和PIK3CA的突变率分别为41.2％,7.9％,0.7％和3.7％.EGFR外显子19、21在女性患者中的突变率明显高于男性(P＜0.01),在肺腺癌患者中的突变率明显高于其他类型肺癌(P＜0.01),在无吸烟史患者中的突变率高于有吸烟史的患者(P＜0.01).相反地,KRAS突变在男性患者中的突变率高于女性(P＜0.05),在肺腺癌中的突变率高于肺鳞癌(P ＜0.005),有吸烟史患者的突变率高于无吸烟史患者(P＜0.01).在肺腺癌患者中PIK3CA的突变率明显低于其他类型肺癌(P＜0.01).结论:EGFR和KRAS基因突变率与性别、组织学类型及吸烟史密切相关.在检测中发现EGFR和KRAS双突变,此外PIK3 CA突变并非与EGFR和KRAS突变互斥.
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兔免疫球蛋白液相芯片的制备及其检测方法的建立
目的 制备实验兔的免疫球蛋白液相芯片,建立液相芯片技术(xMAP)检测方法.方法 分别将兔IgG、IgM和IgA亲和纯化的捕获抗体耦联至荧光编码微球,对蛋白耦联量进行优化,制备兔IgG、IgM和IgA液相芯片,同步检测白毛黑眼兔(WHBE兔)和日本大耳白兔(JW兔)血清中IgG、IgM和IgA相对含量,建立可应用于实验兔免疫球蛋白半定量检测的xMAP方法,并对其结果用ELISA方法进行验证.结果 (1)IgG、IgM和IgA的佳蛋白耦联量分别为10、20和15μg.(2)xMAP检测结果显示,WHBE兔血清中IgG、IgM蛋白含量显著低于JW兔(P＜0.05),IgA蛋白含量显著高于JW兔(P＜0.01); ELISA检测结果表明,WHBE兔血清中IgG、IgM蛋白含量显著低于JW兔(P＜0.05,P＜0.01),其中IgM蛋白含量变化达到极显著水平,IgA蛋白含量显著高于JW兔(P＜0.01).结论 应用制备的兔IgG,IgM和IgA液相芯片建立的xMAP方法,对实验兔血清进行检测,检测结果与ELISA结果一致,提示该方法可应用于实验兔血清的IgG、IgM和IgA半定量检测.
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液相芯片技术及其在蛋白质和核酸检测中的应用
Luminex液相芯片技术是1990年代兴起的,集合流式细胞技术、激光技术、微球数字信号处理技术为一体的新型检测技术.与传统的临床检测方法相比,其主要优点在于高通量、高敏感、重复性高、检测范围广、反应速度快,仅需微量样品即可进行检测等.Luminex具有两大核心技术:xMAP(R)技术和xTAG(R)技术.xMAP(R)技术利用抗原-抗体反应的原理,可用于蛋白质和核酸的检测;xTAG(R)技术能够测定若干基因组形式,如基因表达分析、微RNA分析、单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,SNP)分析、特定序列的检测等.
