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大鼠皮质少突胶质细胞培养条件的优化
背景：由于少突胶质细胞主要来自少突前体细胞，实验通过提取少突胶质前体细胞获取少突胶质细胞的过程中，选择合适的培养基和细胞接种密度对生长及形态学观察具有重要影响。目的：对比优化少突胶质细胞的培养条件。方法：取48 h内的SD新生鼠大脑皮质前体少突胶质细胞。分别用DMEM/高糖、DMEM/F12培养基培养少突胶质前体细胞，每组接种密度分别2×104/cm2，4×104/cm2，8×104/cm2，16×104/cm2，32×104/cm2，64×104/cm2；分别于少突胶质前体细胞贴壁72 h后，进行诱导分化，分化7 d后的少突胶质前体细胞在光镜下观察细胞形态变化并通过免疫荧光技术对细胞进行鉴定。结果与结论：DMEM/高糖、DMEM/F12培养基以2×104/cm2，4×104/cm2，8×104/cm2接种密度时，可辨识完整少突胶质前体细胞形态。诱导分化7d后，免疫荧光鉴定提示3组少突胶质前体细胞均可呈现髓鞘碱性蛋白阳性，F12组中2×104/cm2，4×104/cm2，8×104/cm2接种密度条件下细胞均数分别为16.40±3.30，49.95±2.33，76.95±4.86，高于相应条件下的高糖组12.65±2.53，32.10±1.17，54.05±1.56(P<0.05)。结果表明，DMEM/F12较DMEM/高糖培养基适于少突胶质细胞培养，在一定范围内，少突胶质前体细胞分化为少突胶质细胞随接种密度成梯度增多，接种密度在4×104/cm2-8×104/cm2范围对观察细胞形态观察较为适合。
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细胞周期蛋白依赖性激酶PFTK1在少突胶质前体细胞分化中的潜在作用
背景：少突胶质细胞主要来自少突胶质前体细胞，该分化过程被多种因子严格调控。一些细胞周期蛋白依赖性激酶可以调控少突胶质前体细胞分化的早期阶段，对少突胶质细胞形成具有重要意义。
目的：分析细胞周期蛋白依赖性激酶PFTK1在少突胶质前体细胞分化中的潜在作用及相应机制。
方法：利用siRNA技术和Western印迹实验来检测OLN-93细胞分化的相关分子标志物及相应信号通路的活化情况。
结果与结论：撤去血清后，少突胶质前体细胞系OLN-93细胞可进行自发分化。形态观察表明，用siRNA技术沉默PFTK1基因表达后，OLN-93细胞的分化得以明显加快。Western印迹实验显示PFTK1基因沉默后， OLN-93分化的相关分子标志物环核苷酸磷酸二酯酶和髓鞘少突胶质细胞糖蛋白的诱导出现显著增加。对PFTK1相关信号通路的研究则发现，PFRK1基因的沉默表达可诱发 PI3K/AKT 信号通路的活化。而对PI3K/AKT信号通路的特异性抑制可抵消PFTK1沉默对OLN-93细胞分化的促进效果。实验结果首次发现细胞周期蛋白依赖性激酶PFTK1可通过PI3K/AKT信号通路抑制少突胶质前体细胞的分化，为脱髓鞘引起的神经退化性疾病的治疗提供了重要的理论参考。 -
少突胶质前体细胞治疗脊髓损伤的研究进展
脊髓损伤(spinal cord injury,SCI)是一种严重危害人类生命健康的疾病,其发病率呈现逐年上升的趋势,并且治疗较为困难.研究发现脊髓损伤后少突胶质细胞大量死亡,引发脱髓鞘病变,这可能是其难以治疗的原因之一.少突胶质前体细胞(OPCs)为少突胶质细胞的祖细胞,后者是中枢神经系统的成髓鞘细胞.OPCs来源于胚胎发育早期神经管腹侧神经上皮细胞,随着神经管的发育,OPCs逐渐增殖、迁移并分化为成熟OL,参与中枢神经系统轴突髓鞘的形成.随着对OPCs的不断深入研究,发现OPCs移植对SCI有较好的疗效,这可能为SCI患者开辟一条新的治疗途径.本文就OPCs治疗SCI的动物实验研究结果做一综述.
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局灶脑缺血再灌注后成年大鼠大脑MyT1表达变化
目的 探讨脑缺血再灌注后成年大鼠大脑MyT1表达变化及其意义.方法 以线栓法制作成年SD大鼠局灶性脑缺血再灌注模型(阻塞90min再灌注1,7,14d);用免疫荧光组织化学法检测脑缺血再灌注成年大鼠早期大脑梗死中心区、梗死周边区和缺血对侧区MyT1阳性细胞数量.结果 (1)脑缺血再灌注后各时间点梗死中心区MyT1阳性细胞数明显减少;(2)脑缺血再灌注后梗死周边区MyT1阳性细胞数从脑缺血后第1天开始增加;脑缺血后7d和14d时,各组大鼠MyT1阳性细胞增加数较之对照组大鼠有显著的差别.结论 成年SD大鼠脑缺血再灌注后梗死周边区MyT1表达显著增加,可能参与了少突胶质前体细胞的发育过程,调节髓鞘蛋白基因的转录,参与缺血性脑损伤的修复过程.
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两类抗精神病药对脱髓鞘小鼠模型髓鞘修复的影响
目的:探讨抗精神病药物对双环己酮草酰二腙(CPZ)诱导的慢性脱髓鞘动物模型中髓鞘修复的作用.方法:持续给予CPZ喂养12周诱导小鼠慢性脱髓鞘模型,采用快蓝染色、髓鞘碱性蛋白(MBP)免疫组织化学显色等方法检测各组髓鞘变化,观察典型性抗精神病药氟哌啶醇和非典型性抗精神病药喹硫平对髓鞘修复的作用.通过免疫组织化学标记少突胶质前体细胞(OPCs)标志物Olig2,比较药物对OPCs的影响.结果:氟哌啶醇可以阻止髓鞘的自发性修复;喹硫平能促进慢性髓鞘再生的进程.在髓鞘修复过程中氟哌啶醇使OPCs数目减少;喹硫平可以促进OPCs增生.结论:在脱髓鞘模型中,氟哌啶醇抑制髓鞘自发修复,喹硫平可以促进髓鞘的慢性修复,其机制可能与两种药物对OPCs的不同作用有关.OPCs可能是抗精神病药治疗的靶点.
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血清-糖皮质激素诱导激酶1基因对少突胶质细胞分化的影响
目的:探讨血清-糖皮质激素诱导激酶1(SGK1)对少突胶质细胞分化的影响.方法:利用免疫荧光染色检测糖皮质激素对体外培养少突胶质前体细胞(OPCs)分化的影响;原位杂交检测SGK1在少突胶质细胞中的表达情况;通过构建SGK1真核表达载体和鸡胚神经管电穿孔转化,研究SGK1过表达对少突胶质细胞发生发展的影响.结果:在体外,SGK1的激活物氢化可的松能促进OPCs分化;抑制物GSK650394则会阻断OPCs分化,鸡胚神经管过表达SGK1会促进少突胶质细胞转录因子2和Sox10的提前表达.结论:SGK1能促进少突胶质前体细胞的发生及分化.
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B104CM对早期培养时大鼠O2A祖细胞迁移的促进作用
目的:研究B104CM对体外培养条件下的少突胶质前体细胞的促迁移作用.方法:取新生SD大鼠大脑皮质原代混合培养少突胶质前体细胞,B104神经胶质瘤细胞株条件培养液增殖并纯化,琼脂糖滴迁移实验观察B104CM对少突胶质前体细胞迁移的影响.结果:B104CM实验组可以促进少突胶质前体细胞的迁出,迁移速度有时段上的差别.结论:B104CM对体外培养的少突胶质前体细胞有增殖作用的同时,还可促进其迁移.
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新生大鼠少突胶质前体细胞的培养
体外培养少突胶质细胞已证明其细胞学特征与在体的发育相近[1～3],而且改变了以前对少突胶质细胞突起较少的错误认识.少突胶质细胞的形态、功能、发育以及与神经元的相互联系逐渐被神经科学工作者所重视,而其前体细胞的增殖和纯化是进一步研究的基础.少突胶质前体细胞的连续发育过程报道也较少.本室在既往研究的基础上对少突胶质前体细胞的体外培养方法进行改良,然后对少突胶质细胞系部分发育阶段进行了形态学观察,以期为深入了解少突胶质细胞系的细胞生物学特性及探索发育神经生物学的规律提供帮助.
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缺氧低糖培养对少突胶质前体细胞的影响
目的:探讨缺氧低糖环境对体外培养少突胶质前体细胞(O2A细胞)的影响.方法:应用台盼蓝染色计数细胞存活率,Hochest33258荧光染色及流式细胞仪分析细胞凋亡情况,透射电镜观察细胞形态变化.结果:缺氧培养3h细胞变化不明显,但缺氧培养6h,细胞存活率明显下降,凋亡细胞明显增多,并且随着缺氧时间延长存活细胞更少、凋亡细胞更多,至缺氧培养12h,大多数细胞破碎.结论:低糖联合缺氧培养模式可以建立可行的O2A细胞外缺氧模型.
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少突胶质前体细胞分化的调节机制
少突胶质前体细胞形成中枢神经系统轴突的髓鞘.近年来,少突胶质前体细胞(OPC)以具有自我更新、分化及髓鞘化中枢神经系统轴突的潜能而引起关注.本文将综述在发育过程中调控OPC分化的分子机制,主要包括细胞骨架水平、转录水平、时空水平以及轴突水平等方面.
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脂多糖诱导小胶质细胞依赖的早产鼠脑白质损伤机制研究
目的 研究中枢神经系统小胶质细胞(MG)正常发育尤其是少突胶质细胞前体细胞(OPCs) 易受损阶段的发育,探讨宫内感染早产鼠MG依赖的OPCs损伤机制.方法 ①观察正常C57B/L鼠不同胎龄(孕10、15 d )和生后(0、5、10 d)MG和OPCs在脑白质的发育分布情况,明确两者在发育和分布上的关联.②建立脂多糖(LPS)宫内感染新生鼠模型(宫内分别接种LPS 5、10和20 μg·mL-1为感染A～C组),以PBS溶液接种为对照组.以Tomato lectin作为静息状态MG标志,CD68作为活化MG的特殊抗体,O4+作为OPCs抗体,抗体浮片法进行免疫组化染色并计数分析.③ Western blot法检测各组脑室周围白质组织Toll样受体-4 (TLR-4)蛋白表达.④采用ELISA法检测各组MG活化后IL-2、TNF-α和SOD水平变化.结果 ①MG在孕10 d胎鼠Tomato lectin表达低下,孕15 d胎鼠表达显著增高,MG主要分布在脑室周围白质区域,灰质皮质几乎不表达.出生后,脑室周围白质区域MG的表达有所下降,灰质皮质的表达逐渐增高.②感染A~C组CD68+细胞数量均显著增加,与对照组差异有统计学意义(P<0.01),但感染C组与B组CD68+细胞数量差异无统计学意义(P>0.05).与对照组比较,感染A~C组均可见O4+细胞数量显著性下降(P<0.01),其中以感染C组下降为明显.③对照组未检测到TLR-4蛋白表达,感染A~C组均可见LPS剂量依赖的TLR-4蛋白表达增加,与对照组差异有统计学意义(P<0.05).④随接种LPS剂量增大,IL-2和TNF-α水平较对照组呈显著增加趋势,SOD水平较对照组呈显著降低趋势.结论 新生鼠发育依赖的MG在脑白质受损区域过度表达,表明活化MG起到本底激活效应,是早产儿脑白质损伤的物质基础.
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锂-毛果芸香碱致癎大鼠早期大脑NG2 和O4表达及意义
目的:探讨氯化锂-毛果芸香碱(匹罗卡品)致疒0 间大鼠早期大脑少突胶质前体细胞变化及意义.方法:对雄性成年SD大鼠先后腹腔注射氯化锂、毛果芸香碱,制成癫癎持续状态动物模型;用免疫荧光组织化学法检测癎性发作后早期大鼠大脑皮质和海马CA1区NG2和O4阳性细胞数量.结果:和对照组相比,除癫癎后1 d组外其余各组大鼠脑皮质内NG2和O4阳性细胞都有明显的增加;癫癎后1 d组海马CA1区的阳性细胞数明显减少;癫癎后7 d组皮质和海马CA1区NG2和O4阳性细胞数多.结论:氯化锂-毛果芸香碱致癎大鼠早期大脑NG2和O4表达增加,少突胶质前体细胞增多,并且和观测时间相关.
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胶质瘤的细胞起源
神经胶质瘤是成人常见的原发性脑肿瘤,可能起源自胶质组织.虽然关于胶质瘤的分子机制和信号通路的认知在过去10年里有很大提高,但高级别胶质瘤仍是预后不良的致命性疾病.目前治疗失败的原因很大程度上与胶质瘤细胞的异质性有关.导致异质性的原因之一是其具有大量遗传变异;而另一个影响因素可能是形成胶质瘤的起源细胞类型.胶质瘤的起源细胞仍未确定,需要更多关于这一问题的知识,才能完整理解神经胶质瘤的生物学特征.通过发育生物学和胶质瘤动物模型的实验研究发现具有形成胶质瘤能力的可能候选细胞是星形胶质细胞,神经于细胞和少突胶质前体细胞.不同起始细胞类型的胶质瘤,其预后和治疗反应可能会显著不同.因此,有必要深入研究胶质瘤的细胞起源.
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急性一氧化碳中毒对大鼠大脑少突胶质细胞前体细胞分化功能的影响
目的 探讨急性一氧化碳中毒(acute carbon monoxide poisoning,ACOP)对大鼠大脑少突胶质前体细胞(oligodendrocyte precursor cells,OPCs)分化功能的影响.方法 利用分次腹腔注射制作ACOP大鼠模型,60只SD大鼠按随机数字表法选取45只进行染毒,造模结束后从存活大鼠中随机选取15只作为ACOP组,对照组15只大鼠按同样方案注射空气.分别在造模成功后1、3、7、14 d和30 d时取大鼠脑组织,采用免疫荧光组织化学法分别检测大脑皮质和海马NG2和CC1阳性细胞数目.结果 (1)与对照组相比,ACOP组大鼠脑内NG2阳性细胞胞体形态不规则、皱缩,且突起数量明显减少;(2)与对照组相比,处理后1d和3d时ACOP组大鼠大脑皮层内NG2阳性细胞数目明显较多(P＜0.05);7d时ACOP组NG2阳性细胞数目开始减少(P＜0.05),14 d和30 d时减少更加明显(P＜0.01).CC1阳性细胞数目处理后第3天开始减少(P＜0.05),7d时明显(P＜0.01),14 d和30 d时CC1阳性细胞数目亦较对照组少(P＜0.05).但与14 d相比,30 d时ACOP组大鼠脑内皮层CC1阳性细胞数目增加约50％.(3)与对照组相比,处理后1d时ACOP组大鼠大脑海马内NG2阳性细胞数目明显较多(P＜0.01);3d时NG2阳性细胞数目稍减少(P＞0.05),7、14 d和30 d时明显减少(P＜0.01).ACOP组大鼠大脑海马内CC1阳性细胞数目处理后1、3、7、14 d和30 d时均较对照组减少(P＜0.05).结论 大鼠ACOP后OPCs和少突胶质细胞(oligodendrocytes,OLs)均会受到不同程度的损伤,同时可能会调动机体自我修复能力,诱导OPCs增殖、分化成为成熟的OLs,从而实现髓鞘损伤修复.
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少突胶质前体细胞与髓鞘形成及再生的研究进展
脱髓鞘病变可阻碍神经系统电传导,导致功能障碍.髓鞘再生由广泛分布于成体的少突胶质前体细胞(OPC)介导.理解少突胶质细胞生理学,了解髓鞘形成与维稳机制,了解在某些主要神经系统病变(如多发性硬化)CNS髓鞘再生失败与内源性OPC数量、迁移以及形成髓鞘能力的关系,对于改善髓鞘修复策略具有重要意义.
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少突胶质前体细胞分离培养方法的改进及其谱系限定细胞体外分化模型的建立
目的 对少突胶质前体细胞(OPCs)的分离、培养及传代方法进行改良,并建立少突胶质谱系限制细胞的体外分化模型,以模拟体内OPCs的发育过程.方法 通过非特异性差异黏附法与A2B5-IgM抗体免疫筛选法结合,从胚胎大鼠脊髓来源的细胞悬液中分离、纯化OPCs,用含成纤维细胞生长因子-2和血小板源性生长因子的培养液作扩增培养；再以三碘甲状腺氨酸和神经营养因子-3诱导OPCs分化,终分化为成熟的少突胶质细胞(OLs).OPCs及其分化细胞的特性通过形态学观察和免疫化学染色法鉴定.结果 95％以上的细胞具有双极或三极突起的典型OPCs形态,并表达A2B5；在一定的培养条件下,OPCs可持续扩增和反复传代,且扩增的OPCs仍能维持其特有的形态和自我增殖的特性；进入分化进程的细胞将依次表达04、Ol、受体反应蛋白及髓鞘碱性蛋白等特异性分化抗原.结论 分离的OPCs在形态、增殖以及分化格局等方面均与存在于胚胎脑区的02A的体细胞(体内OPCs)相类似.
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神经干细胞向少突胶质前体细胞的定向分化诱导
本研究采用神经胶质瘤细胞株(B104 neuroblatoma cells,B104 cells)培养上清(B104CM)和碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor,bFGF),将冷冻复苏的大鼠胚胎脊髓神经干细胞(neural stem cells,NSCs)定向诱导为少突胶质前体细胞(oligodendrocyte precusor cells,OPCs).形态学和免疫组化的结果显示,诱导后95%以上的细胞具有双极或多极突起的典型OPCs形态,并表达A2B5和血小板源生长因子受体-α(platelet derived growth factor receptor-α,PDGFR-α)等OPCs标志,所有PDGFR-α阳性的OPCs均不表达β-TublinⅢ,其中仅少量细胞表达胶质原纤维酸性蛋白(glia fibrillary acidic protein,GFAP).在B104CM和bFGF共存的培养条件下,悬浮培养的OPCs可大量增殖形成少突胶质细胞球,该细胞球可通过传代继续扩增,且扩增的OPCs仍能维持其特有的形态和自我增殖的特性.撤去bFGF和B104CM后,OPCs能进一步分化为成熟的少突胶质细胞(oligodendrocytes,OLs)或Ⅱ型星形胶质细胞.实验表明,诱导NSCs产生的OPCs在形态、增殖以及分化格局等方面均与已报道的存在于胚胎脑区的O-2A前体细胞相类似.该培养系统可为实验性细胞移植的研究提供丰富的细胞来源.
关键词： 神经干细胞 少突胶质前体细胞 B104细胞 碱性成纤维细胞生长因子 -
少突胶质细胞缺血性损伤
在缺血性脑损伤中,对于神经元的病理生理学变化已经进行了深入的研究,而对少突胶质细胞的缺血性损伤则关注不多.作为中枢神经系统合成髓鞘的惟一细胞,少突胶质细胞的缺血性损伤和反应对缺血性卒中的功能恢复有重要的影响.深入了解少突胶质细胞缺血性损伤的机制将为探索其保护治疗提供依据.文章对少突胶质细胞的生物学特性、缺血性损伤和机制以及保护性治疗的进展进行了综述.
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脂多糖对部分神经胶质细胞NgR表达的实验研究
目的:观察脂多糖诱导早产鼠小胶质细胞和少突胶质前体细胞NgR的表达及变化, 了解NgR表达在TLR-4介导的神经胶质细胞释放炎性细胞因子中的作用. 方法: 采用振荡和差速贴壁法体外纯化培养MG和OPCs, 分别用特异性抗体CD11b和O4做细胞鉴定; 用实时荧光定量PCR检测各组MG、OPCs的NgR和MG的TLR-4基因表达情况, 并用ELISA测各组TNF-α 的含量. 结果: LPS诱导后较其他对照组及处理组MG的TLR-4表达水平和MG、OPCs的NgR表达水平均增高, 差异具有统计学意义 (P ＜ 0.05), 各组MG经LPS诱导后较其对照组及处理组的TNF-α 的含量增高, 差异具有统计学意义 (P ＜ 0.05). 结论:细菌感染使MG和OPCs的NgR表达增高; 脂多糖诱导小胶质细胞表达大量TLR-4需要NgR的介导; TLR-4可能存在上调NgR基因表达的作用.
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新生大鼠大脑皮层少突胶质前体细胞的培养分离及鉴定
[目的] 探讨新生(sprague dawley,SD)大鼠大脑皮层少突胶质前体细胞在体外条件下的生长情况及培养分离,以获得纯化的少突胶质前体细胞,为今后细胞移植治疗研究提供良好的种子细胞.[方法] 出生48 h SD大鼠取大脑皮层进行混合胶质细胞的体外培养,原代培养第9～10 d时采用水平振荡、差速贴壁的方法分离、纯化少突胶质前体细胞,继续用定向培养基传代培养.相差显微镜观察少突胶质前体细胞在体外条件下的生长情况,免疫细胞化学技术进行细胞鉴定.[结果] 混合胶质细胞原代培养第9～10 d时出现明显的细胞分层,少突胶质前体细胞散布于单层的星形胶质细胞表面,胞体呈椭圆形或圆形,具有典型的双极突起,少数呈三极突起.经振荡分离后少突胶质前体细胞纯度达95%,少突胶质细胞特异性标记Olig02反应阳性,胶质纤维酸性蛋白抗体反应阴性.[结论] 新生SD大鼠大脑皮层原代培养中少突胶质前体细胞能够维持在未成熟阶段,细胞分层后通过振荡法及差速贴壁法可以获得较高纯度的少突胶质前体细胞.
