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二甲双胍对AGEs诱导人结肠癌细胞SW-480增殖作用的影响及机制的初探
目的 探讨二甲双胍(Met)对晚期糖基化终末产物(AGEs)诱导人结肠癌细胞株SW-480增殖作用的影响及机制.方法 实验以体外培养的SW-480细胞为研究对象,分为小牛血清白蛋白(BSA)组,AGE组,AGE+ Met组,BSA+Met组,各组均干预72 h.四氮唑蓝(MTT)法测定细胞活力,流式细胞术测定细胞周期,Western blot检测周期蛋白D1(CyclinD1)的表达水平,TRAP银染法测定端粒酶活性.结果 AGE组的细胞活力、CyclinD1的表达、端粒酶活性较BSA组显著增加,G0/G1期比率较BSA组显著减少(P均＜0.05)；与BSA、AGE组相比,AGE+ Met及BSA+ Met组细胞活力、CyclinD1表达、端粒酶活性显著降低,而G0/G1期比率显著增加(P均＜0.05).结论 二甲双胍能通过下调CyclinD1的表达减慢G1/S期转换,减弱端粒酶活性,抑制SW-480细胞的生长,并抑制AGEs诱导的促SW-480生长作用.
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过表达上皮膜蛋白1对结直肠癌SW-480细胞生物学行为的影响及其可能的机制
目的:探讨上皮膜蛋白1(epithelial membrane protejn-1,EMP1)在人结直肠癌(colorectal carcinoma,CRC)组织中的表达水平及其过表达对CRC SW480细胞增殖、凋亡和侵袭的影响.方法:免疫组织化学、Western blotting方法检测63例CRC组织及31例癌旁组织中EMP1的表达水平,分析EMP1表达与CRC临床病理参数的关系.慢病毒介导将pLenti6-EMP1质粒转染SW-480细胞,建立EMP1过表达细胞,转染plenti6/V5-DEST空白质粒为对照.Real-time PCR及Western blotting检测转染后SW-480细胞株中EMP1的表达,MTF、流式细胞术及Transwell实验分别检测EMP1过表达对SW-480细胞增殖、凋亡及侵袭能力的影响.结果:EMP1蛋白在人CRC组织的表达显著低于癌旁组织(0.257±0.022 vs0.863±0.086,P＜0.05),并且其表达水平在不同T分期、有无淋巴结转移、临床分期以及组织分级组间表达有显著差异(P＜0.05),而与患者年龄、性别、肿瘤部位无关(P＞0.05).成功构建EMP1过表达的LeEMP1细胞.与LeEmpty细胞相比,LeEMP1细胞的增殖能力显著下降[(60.94±4.04)％ vs (100.00±0.00)％,P＜0.05],凋亡率显著升高[(12.10±1.30)％ vs (3.10±0.60)％,P＜0.05]、侵袭转移能力显著降低[穿膜细胞数:(87.00± 12.00)vs (178.00 ±21.00)个,P＜0.05].LeEMP1细胞Caspase-9表达显著高于LeEmpty细胞(0.764±0.073 vs0.231±0.029,P＜0.05),VEGFC表达显著降低(0.185±0.022 vs0.663±0.065,P ＜0.05).结论:人CRC组织中EMP1蛋白表达明显减低,过表达EMP1能够抑制CRC SW-480细胞的恶性生物学行为,其可能通过调控Caspase-9和VEGFC的表达来发挥作用.
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靶向hTERT的RNAi载体的构建及其对大肠癌SW-480细胞增殖的影响
目的:构建靶向人大肠癌细胞端粒酶逆转录酶(human telomerase reverse transcriptase,hTERT)基因的RNAi载体,探讨其对人大肠癌SW480细胞增殖的影响.方法:设计3条靶向hTERT的shRNA序列和阴性对照序列,分别克隆入pGPU6/GFP/Neo载体,构建RNAi载体pGPU6-hTERT-1、2、3和阴性对照载体pGPU6-hTERT-NC,转染SW480细胞.RT-PCR检测各组载体对hTERT mRNA表达的影响,MTT法检测下调hTERT mRNA表达对SW480细胞增殖的影响.结果:成功构建3个携带hTERT mRNA序列的重组载体,3种RNAi载体均能明显抑制SW480细胞hTERT mRNA的表达,pGPU6-hTERT-3组SW480细胞hTERT mRNA表达水平较空白对照组下调为显著(0.347±0.028 vs 0.513±0.032,P＜0.01).转染3种RNAi载体均能明显抑制SW480细胞增殖,pGPU6-hTERT-3组细胞增殖抑制率较空白对照组、脂质体对照组和pGPU6-hTERT-NC组升高为显著[(50.08±0.43)％ vs (4.11 ±0.39)％、(3.88±0.35)％、(3.38±0.35)％,P＜0.05].结论:转染RNAi载体pGPU6-hTERT-3能够抑制SW480细胞的增殖,其机制可能与降低hTERT基因的表达从而抑制端粒酶活性有关.
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藻红蛋白对人结肠癌SW-480细胞凋亡的诱导作用
目的 研究藻红蛋白(PE)对人结肠癌SW-480细胞凋亡的诱导作用.方法 采用MTT法检测PE对SW-480细胞的生长抑制作用,流式细胞仪检测PE对SW-480细胞凋亡的影响.采用激光共聚焦显微镜Annexin V-FITC/PI双荧光染色观察藻红蛋白作用后SW-480细胞的变化.结果 PE对SW-480有较强的生长抑制作用,并呈剂量-效应关系(r=0.87,P<0.01),当PE剂量为40 μg/mL,作用时间48 h时,其对SW-480细胞的抵制率达54.01%,IC50值为34.32 μg/mL.结论 PE对SW-480细胞有较强的抑制作用,可以诱导其凋亡.
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酪酸梭菌诱导结肠癌SW-480细胞凋亡及作用机制
目的 探讨酪酸梭菌(Clostridium butyricum,CB)诱导人结肠癌SW-480细胞凋亡的作用及机制.方法 采用不同浓度的酪酸梭菌(1.5×103、1.5 ×104、1.5×105、1.5×106、1.5×107、1.5×108 CFU/mL)在不同作用时间(24、48、72、96 h)处理结肠癌SW-480细胞后,CCK8法检测CB对SW-480细胞的增殖抑制.电镜观察CB对SW-480细胞形态的影响.Annexin V-FITC/PI双标法检测细胞凋亡.Caspase试剂盒检测SW-480细胞中Caspase-3和Caspase-9的活性.Western blot法检测SW-480细胞Bax和Bcl-2凋亡蛋白表达的变化.结果 酪酸梭菌对SW-480细胞的生长抑制作用呈明显的时间-剂量依赖性;菌液浓度为1.5×107 CFU/mL和1.5×108CFU/mL的酪酸梭菌处理后的SW-480细胞形成典型的凋亡小体;酪酸梭菌(1.5×107 CFU/mL和1.5×108CFU/mL)处理能显著增强SW-480细胞Caspase-3和Caspase-9的活性,促进SW-480细胞凋亡(P＜0.01);随着菌液浓度的增加,凋亡蛋白Bax的表达增强,而抑凋亡蛋白Bcl-2的表达减弱.结论 酪酸梭菌可诱导SW-480细胞凋亡,其作用机制与凋亡相关基因Bax、Bcl-2和caspase-3、caspase-9的表达有关.
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SW-480裸鼠移植瘤模型的建立及其生物学特性
目的:建立生物学特性稳定的结肠高分化腺癌裸小鼠移植瘤模型.方法:建立人结肠高分化腺癌细胞株SW-480裸小鼠移植瘤模型,并确定移植瘤生长情况、组织学变化及细胞动力学改变等生物学特性 .结果:移植瘤体内传代稳定,潜伏期7～8d;保留了人结肠腺癌的组织学特征;细胞动力学检测显示以四倍体细胞为主;移植瘤细胞具有分泌CEA的功能. 结论:本移植瘤模型是一个生物学特性较稳定的人结肠高分化腺癌裸小鼠移植瘤模型.
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重组人肿瘤坏死因子对人结肠癌SW-480细胞的体内作用
目的:探讨TNF抗大肠癌的作用及其机制.方法:建立人结肠腺癌裸小鼠移植瘤模型,观察rhTNF对人结肠腺癌SW-480裸小鼠移植瘤重量、组织学和超微结构及细胞周期动力学的影响.结果:rhTNF对人结肠腺癌裸小鼠移植瘤具有抑制作用,抑瘤作用呈剂量依赖性;结肠癌细胞围绕血管出现片状坏死,并有大量炎细胞浸润;rhTNF能明显抑制结肠癌细胞从G0/G1期过渡到S和G2M期,使细胞增殖指数显著降低,DNA抑制率呈剂量依赖性.结论:rhTNF对大肠癌生长具有抑制作用,可能与rhTNF诱导的炎症反应及血管损伤有关;rhTNF能特异性抑制大肠癌细胞从G0/G1期向S和G2M期过渡,进而抑制DNA合成.
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hsa-mir-520真核表达载体的构建及对E-钙粘蛋白表达的影响
目的 构建hsa-mir-520真核表达载体,并转染大肠癌细胞SW-480细胞,检测细胞中E-钙粘蛋白表达情况.方法 依据miRBase数据库中hsa-mir-520序列,设计并合成寡核苷酸片段,构建hsa-mir-520表达载体和对照载体.采用脂质体转染方法分别将mir-520表达载体、及对照质粒转染大肠癌细胞SW-480细胞株.采用酶切、测序检测载体构建;Western blot检测E-钙粘蛋白的表达.结果 酶切和测序表明hsa-mir-520真核表达载体构建成功.Western blot结果显示与转染对照质粒和未转染的细胞相比,转染了hsa-mir-520重组质粒的细胞中E-cadherin蛋白的表达明显增加(P<0.01),密度扫描半定量分析显示E-cadherin蛋白的表达增加了大约40%.结论 成功构建了hsa-mir-520和对照的真核表达载体,hsa-mir-520质粒转染大肠癌细胞SW-480后可增加E-钙粘蛋白的表达.
关键词： hsa-mir-520 E-钙粘蛋白 SW-480细胞 -
晚期糖基化终产物对人结肠癌细胞SW-480增殖的影响及其机制研究
目的 观察晚期糖基化终产物(advanced glycosylation end prodrcts,AGE)对人结肠癌细胞株SW-480增殖的影响,并探讨其可能机制.方法 不同浓度AGE干预SW-480细胞,噻唑蓝(MTT)法比较各组细胞活力,流式细胞术观察AGE对SW-480细胞周期的影响,蛋白质印迹法观察AGE对SW-480细胞CyclinD1表达的影响,端粒重复序列扩增法(telomeric repeat amplification protocol,TRAP)银染法观察AGE对SW-480细胞端粒酶活性的影响.MTT测细胞活力的检测设置空白对照组、100μg/mL小牛血清白蛋白(bovine serum albumin,BSA)组及50、100、500μg/mL AGE组,其余检测只设置100μg/mL BSA组和100μg/mL AGE组.结果 MTT结果示AGE促进SW-480细胞的增殖,且呈浓度依赖性.100μg/mL BSA组与100μg/mL AGE组72 h后的细胞G0/G1期所占百分比分别为56.02%±0.58%、51.93%±1.01%,差异有统计学意义(P＜0.05).蛋白质印迹法示100μg/mL AGE组72 h后CyclinD1的表达较100μg/mL BSA组增加,差异有统计学意义(P＜0.05).TRAP银染法检测示100μg/mL AGE干预SW-480细胞72 h后可以增加端粒酶活性(P＜0.05).结论 AGE可促进人结肠癌细胞SW-480生长,呈剂量依赖性.其作用机制可能与AGE上调CyclinD1的表达加速G1/S期转换及增加端粒酶活性有关.
