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人羊膜组织细胞的神经干细胞特性形态学研究
目的:利用形态学研究方法,探讨神经干细胞特异性标志蛋白的表达和增殖分化特性.鉴定人类羊膜组织中神经干/前体细胞的存在.方法:利用免疫组织化学法,检测人类羊膜组织和培养人类羊膜细胞中nestin、musashi-1、vimentin和PSA-NCAM等神经十细胞特异性标志蛋白的表达,利用BrdU掺人实验鉴定羊膜组织来源神经干,前体细胞的增殖分化能力.结果:免疫组织化学检测证实人羊膜组织表达nestin、musashi-1、CD133和vimentin等神经干细胞特异性标志蛋白,主要分布于羊膜组织的间质层.培养羊膜细胞的免疫荧光化学染色显示nestin、musashi-1、vimentin和PSA-NCAM阳性细胞的存在.BrdU掺入的组织形态学实验显示培养羊膜细胞中存在BrdU标记阳性细胞.其中具有BrdU与nestin、musashi-1、vimentin双标阳性细胞,显示羊膜细胞中存在具有增殖活性神经干细胞标记蛋白表达阳性细胞;而BrdU与β-tubullin Ⅲ、TH和GFAP双标阳性细胞的存在,表明神经元和胶质细胞是由培养羊膜细胞增殖分化的.结论:羊膜组织中存在神经干细胞特异性标记蛋白Nestin、Musashi-1、CD133、PSA-NCAM和Vimentin表达阳性细胞,BrdU掺入的组织形态学结果不仅证实羊膜细胞中Nestin、Musashi-1、Vimentin 阳性细胞具有增殖活性.而且其中存在已分化的神经元和胶质细胞,提示羊膜组织细胞内存在神经干/前体细胞.
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大鼠羊膜细胞体外培养及其干细胞标记物的表达
目的：分离并鉴定大鼠羊膜细胞，探索羊膜细胞分化潜能，为干细胞移植治疗探寻新的细胞来源。方法机械分离羊膜组织并采用0．25％含EDTA的胰蛋白酶消化，应用高糖－DMEM培养基（添加10μg／L人表皮生长因子）培养，采用流式细胞术检测间充质干细胞表面标志物，通过细胞免疫荧光染色检测神经干细胞表面标记物。结果大鼠羊膜组织可分离并培养，细胞呈梭型，贴壁生长，短期内可以稳定增殖。细胞表达干细胞表面标记物八聚体结合转录因子4（octamer－binding transcription factor，Oct－4）和性别决定区Y框蛋白（sex determining region Y box 2，Sox－2），间充质干细胞表面标志物vimentin，胚胎干细胞标记物阶段特异性胚胎表面标记物（stage specific embryonic antigen－4，SSEA－4），并表达神经干细胞表面标志物nestin，可表达脑源性神经营养因子（ brain derived neurotrophic factor，BDNF）和神经生长因子（ nerve growth factor，NGF）。结论大鼠羊膜细胞可表达间充质干细胞和神经干细胞标记物，并有神经营养因子表达，为大鼠羊膜细胞的研究和应用提供实验依据。
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羊膜细胞Ⅰ型胶原蛋白支架复合物用于修复胎膜破口的研究
目的 探讨羊膜细胞I型胶原蛋白支架复合物用于修复胎膜破口的可行性.方法 将人羊膜间质细胞接种在I型胶原蛋白三维基质中,人羊膜上皮细胞接种在基质的表面,构建羊膜细胞/Ⅰ型胶原蛋白支架复合物以模拟人体羊膜组织结构.DAPI标记三维基质中的细胞核以计数羊膜细胞在三维培养第2,8天的细胞数量.动态测定羊膜细胞/Ⅰ型胶原蛋白复合物体积.培养含有不同数量羊膜间质细胞的羊膜细胞/I型胶原蛋白支架复合物,15 d后检测抗张强度.结果 第2天和第8天的细胞数目分别是(121±5)/cm2和(124±4)/cm2(P>0.05).第5天时,I型胶蛋白的面积为原体积的45%,第10天时约为15%,第15天时约为原14%,羊膜间质细胞的存在对于Ⅰ型胶原蛋白基质具有重新塑形的作用(P<0.01),羊膜间质细胞可以导致I型胶原蛋白的收缩,抑肽酶和GM6001也不能抑制这种收缩.羊膜细胞/Ⅰ型胶原蛋白复合物抗张强度随人羊膜间质细胞数量的增多而增强(P<0.01).结论 羊膜细胞/Ⅰ型胶原蛋白支架复合物有望成为修复胎膜破口的材料.
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纤维蛋白支架三维培养人羊膜细胞的生物学特性
背景:未足月胎膜早破是产科常见的妊娠期并发症,三维培养可使组织缺损恢复解剖学上的完整性,使得细胞培养成为更有实用价值的技术.目的:通过观察人羊膜细胞在纤维蛋白支架上三维培养后的生物学特性变化,探讨细胞/支架复合物模拟体内羊膜组织用于未足月胎膜早破破口修复的可能性,并与普通平面二维培养结果进行比较.设计、时间及地点:细胞～支架学体外观察,于2007-12/2008-11在重庆医科大学基础研究所完成.材料:剖宫产孕妇的羊膜组织,由重庆医科大学附属第一医院妇产科提供.纤维蛋白原为Sigma公司产品.方法:将酶消化法和反复贴壁法相结合,体外分离培养并纯化羊膜上皮细胞和羊膜问质细胞.纤维蛋白原聚合后,取处于对数生长的上皮细胞,接种于纤维蛋白支架表面,模拟胶上型二维立体培养;在纤维蛋白原聚合前,将处于对数生长的间质细胞和纤维蛋白溶液混合,模拟胶内型三维立体培养.同时将上皮细胞年间质细胞接种于24孔板中,进行普通平面二维培养.主要观察指标:倒置显微镜及电镜下观察细胞的形态学特征,不同培养条件下间质细胞的增殖情况,间质细胞和支架的相互作用.结果:在纤维蛋白支架表而,上皮细胞形态较平面培养圆润,细胞间可见伪足伸出,表面微绒毛丰富;在纤维蛋白胶中,间质细胞呈梭形,沿支架伸展,可见细胞在不同平面形成刚络状.三维立体培养下,间质细胞增殖活性平稳,但增长幅度较平面培养缓慢.在胶内型三维立体培养中,随时间的延长纤维蛋白胶发生收缩,凝胶厚度逐渐降低,至第5天纤维蛋白胶厚度占原厚度的40%左右,第15天收缩到原厚度的10%左右.结论:羊膜上皮细胞和羊膜间质细胞能够在纤维蛋白支架上立体生长,增殖活性平稳:在细胞-纤维蛋白支架复合物中,可观察到纤维蛋白胶随着时间推移而发生收缩的现象,提示羊膜细胞-纤维蛋白支架复合物可模拟体内组织,作为胎膜早破破口修复的生物学材料.
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化学合成siRNA转染人羊膜的WISH细胞的效率检测
目的:检索中国期刊全文数据库2005/2008相关文献显示,RNA干扰研究中,转染效率的高低直接决定siRNA 的表达效果,目前关于应用小分子干扰RNA对人羊膜WISH细胞转染效率的检测研究少见.实验应用化学合成siRNA转染人羊膜WISH细胞,通过流式细胞仪检测转染效率,并初步检测转染对细胞凋亡的影响.方法:实验于2007-03/12在广州医学院试验医学研究中心完成.①实验材料:实验中应用的人羊膜WISH细胞株购于中国科学院上海生命科学研究所.②实验方法:应用0,5,10,20,30 nmol/L化学合成的CY3-Negative siRNA转染人羊膜WISH细胞,转染后24 h应用荧光显微镜和流式细胞仪定性、定量评估其转染效率;20 nmol/L CY3-Negative-siRNA转染细胞24 h后,应用Annexin V-EGFP试剂盒检测细胞早期凋亡情况.结果:荧光显微镜显示,5,10,20,30 nmol/L CY3- Negative siRNA转染细胞内均可见红色荧光,对照组无荧光信号.20 ,30 nmol/L CY3-Negative siRNA 的转染效率明显高于5,10 nmol/L组(P < 0.05);20 nmol/L和30 nmol/L siRNA组转染效率差异不显著(P > 0.05).检测20 nmol/L Negative siRNA转染细胞24 h后的细胞早期凋亡情况,转染组与对照组细胞早期凋亡率分别为1.96 %和2.36 %,两组之间细胞早期凋亡率差异不显著.结论:①化学合成的siRNA可以成功转染人羊膜WISH细胞,转染后对细胞的早期凋亡率无影响.②20 nmol/L的siRNA即可获得理想的转染效果.
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羊膜细胞可保护和修复缺血再灌注损伤小鼠脑组织细胞
背景：羊膜细胞主要由羊膜上皮细胞和羊膜间充质细胞组成，均具有多分化潜能，可转化为神经元，且还有合成、释放生物活性物质和神经营养因子的功能。作者前期研究证实羊膜细胞移植入脑内后，能明显促进脑内神经元的再生。目的：探索羊膜细胞对小鼠缺血再灌注损伤脑细胞的作用。方法：将Balb/C小鼠通过夹闭双侧颈总动脉方法建立脑缺血再灌注损伤模型后，分离小鼠脑细胞。取孕鼠新鲜胎盘，分离羊膜细胞。将与羊膜细胞共培养的小鼠脑细胞作为实验组，以PBS培养的小鼠脑细胞作为对照组。结果与结论：实验组小鼠脑细胞活性较对照组明显增加(P<0.05)。培养24，72 h后实验组小鼠脑细胞坏死率较对照组差异无显著性意义(P>0.05)，而培养48 h后实验组小鼠脑细胞坏死率较对照组明显降低(P<0.05)。实验组小鼠脑细胞中S期细胞数量增加，而对照组小鼠脑细胞中G 1期细胞数量增加，S期细胞数量减少，但2组小鼠脑细胞中G 2期细胞数量不变。说明羊膜细胞具有保护缺血再灌注损伤Balb/C小鼠脑细胞的作用，且能抑制其坏死和凋亡并促进其再生。
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羊膜细胞移植对帕金森病鼠纹状体中多巴胺神经元的促再生作用
目的探讨羊膜细胞移植治疗帕金森病(PD)的作用机制.方法通过6-羟基多巴胺(6-OHAD)立体定向注射破坏一侧黑质,制成PD大鼠模型,然后将鼠成活羊膜细胞悬液植入受损侧纹状体,并与死羊膜细胞移植及生理盐水假移植对照.结果活羊膜细胞移植可减少大鼠的异常旋转行为,尤其有意义的是在活羊膜细胞移植靶点周围出现了来源于宿主的酪氨酸羟化酶(TH)阳性神经纤维.结论活羊膜细胞移植能够增加PD鼠纹状体中多巴胺(DA)神经纤维的数目,到底是纹状体残存多巴胺神经元的再生,还是羊膜细胞分泌的营养因子激活了脑内神经干细胞的生长还有待进一步研究.
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羊膜细胞培养液对胎儿卵巢组织雌二醇分泌的实验研究
目的观察胎儿卵巢在体外培养条件下及羊膜细胞培养液条件培养液对分泌雌二醇(E2)的影响,旨在为卵巢移植提供较好的供体培养方法.方法取20～28周妊娠水囊引产的胎儿卵巢,将其切成碎块进行一般培养液直接培养(A组)及加羊膜细胞培养液培养(B组).培养后测定两种不同培养液中E2含量并进行比较.结果胎儿卵巢在一般培养液和加羊膜细胞培养液培养条件下能产生E2,随培养时间延长,E2分泌量增加.而加羊膜细胞培养液组E2分泌量高于一般培养液直接培养(P<0.05).结论胎儿卵巢在一般培养液培养条件下能分泌E2,而加羊膜细胞培养液能促进培养的卵巢组织的E2分泌,可作为卵巢移植的供体培养的较好培养液.
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人胎盘羊膜及绒毛膜细胞在新生SD大鼠体内增殖的研究
目的 观察人胎盘干细胞在新生SD大鼠体内的增殖情况.方法 取5份人胎盘的羊膜、绒毛膜组织,经清洗去血、剪碎、胰蛋白酶消化、淋巴细胞分离液分离制备单个核细胞.SD大鼠出生后第2天,经腹腔注射植入4×106个新鲜制备的细胞.分别于注射后第15、30、45天处死大鼠,取骨髓、脾脏、胸腺组织,用聚合酶链反应(PCR)法检测人特异的Alu基因.结果 大鼠骨髓、胸腺在移植后15 d未检测到人Alu基因的表达,30、45 d均有表达;肝脏中直到45 d时才有Alu基因的表达.结论 人胎盘羊膜、绒毛膜细胞可在新生SD大鼠体内增殖.
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羊膜细胞移植于帕金森病鼠纹状体的实验研究
目的探讨非多巴胺能组织-羊膜细胞移植治疗帕金森病(PD)的作用机制.方法通过6-羟基多巴胺(6-OHAD)立体定向注射破坏一侧黑质,制成PD大鼠模型,然后将鼠成活羊膜细胞悬液植入受损侧纹状体,与死羊膜细胞移植及生理盐水假移植对照.结果发现活羊膜细胞移植可抑制大鼠的异常旋转行为,酪氨酸羟化酶(TH)免疫组化结果显示在活羊膜细胞移植靶点周围出现了TH阳性物质.结论活羊膜细胞诱导了宿主纹状体残存多巴胺(DA)神经纤维的再生,提示羊膜细胞能够分泌对在体DA神经元具有营养作用的物质.
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17β-雌二醇对人羊膜细胞β-防御素-4(HBD-4)表达调节的影响
目的 探讨17β-雌二醇(E2)对人羊膜细胞内β-防御素-4(HBD-4)基因表达的影响.方法 体外培养的人羊膜细胞内添加17β-雌二醇(2nM)培养4h、8h、12h、24h,同时各时间点设相应的对照组(Control组),通过real-time RT-PCR技术检测17β-雌二醇对人羊膜细胞内HBD-4 mRNA的表达变化的影响.结果 17β-雌二醇可上调人羊膜细胞中HBD-4 mRNA的表达(P＜0.05).结论 HBD-4在女性妊娠期羊膜细胞宿主免疫防御中起着重要的作用.
