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二甲双胍对2型糖尿病大鼠肠道L细胞及味觉受体的影响
目的：观察二甲双胍对于2型糖尿病大鼠肠道L细胞功能及味觉受体相关蛋白的影响。方法将18只健康的8~10周龄雄性Wistar大鼠经高糖高脂饮食4周后予链脲佐菌素（ STZ）成模。随机分为三组：模型组﹢二甲双胍、模型组﹢普食；对照组。分别于成模干预前和干预第6周时行口服糖耐量实验（ OGTT ），并测血脂及胰高血糖素样肽-1（GLP-1）表达量。第6周时处死大鼠，并留取肠道组织标本运用real-time RT-PCR法检测胰高血糖素原（PG）基因， Western blot检测葡萄糖转运蛋白-2（GLUT-2）、味觉受体T1R2、T1R3及Gαgust蛋白的表达。结果干预后二甲双胍组和正常组的随机血糖均较干预前明显下降，差异有统计学意义（ P ﹤0.01），且二甲双胍组下降更明显（ P ﹤0.05）。干预后二甲双胍组血清总胆固醇（CHOL）较干预前明显改善（ P ﹤0.05），低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）、甘油三酯（TG）均较干预前也有所下降，但差异无统计学意义（ P ﹥0.05），且与正常组、对照组干预后相比，二甲双胍组CHOL明显下降（ P ﹤0.01），LDL-C及TG也有所下降，但差异无统计学意义（ P ﹥0.05）。干预6周后，二甲双胍组空腹血清GLP-1的表达量较干预前增加，且比正常组和对照组高，差异有统计学意义（ P ﹤0.05）；高糖负荷后，二甲双胍组血清GLP-1表达水平明显增加，且与正常组及对照组相比差异有统计学意义（ P ﹤0.05）。结论二甲双胍具有良好的降糖降脂的作用；二甲双胍可能具有通过上调肠道L细胞内PG基因的表达，从而促进肠道L细胞GLP-1的产生，同时影响GLUT-2、味觉受体及其下游的信号因子Gαgust表达，进而间接起到降糖的作用。
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糖基化终产物对P38MAPK/NF-κB通路诱导的肠道L细胞损伤的影响
目的 探讨糖基化终产物(AGEs)在其下游信号通路诱导的肠道L细胞(GLUTag)致炎症损伤中的作用及其机制.方法 将肠道L细胞分成6组,即空白对照组、BSA对照组、100μg/ml AGEs干预组、200μg/ml AGEs干预组、300μg/ml AGEs干预组、apocynin(NADPH氧化酶阻断剂)+AGEs(200μg/ml)共培养干预组.各组细胞培养24h后,采用ELISA检测胰高血糖素样肽-1(GLP-1)分泌水平和炎症因子肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白细胞介素1(IL-1)、IL-6的表达水平,RT-PCR检测p38MAPK及NF-κB p65 mRNA水平,Western blotting检测p38MAPK、磷酸化p38MAPK(p-p38MAPK)和NF-κB p65蛋白表达水平.结果 与对照组相比,AGEs干预肠道L细胞后,AGEs浓度越高,GLP-1分泌水平下降越明显,呈剂量依赖性(p＜0.05),同时p38MAPK及NF-κB p65 mRNA水平明显升高,亦呈剂量依赖性(p＜0.05),而炎症因子TNF-α、IL-1、IL-6分泌水平也随着AGEs浓度的升高而升高.与AGEs干预组相比,在apocynin干预后,NADPH氧化酶活性受到抑制,GLP-1分泌水平明显升高(P＜0.05).此外,p-p38MAPK和NF-κB p65蛋白表达水平变化与上述mRNA变化趋势一致.结论 AGEs与AGEs受体(RAGE)结合后激活NADPH/p38MAPK/NF-κB信号通路,可能是肠道L细胞早期炎症损伤并终导致GLP-1分泌减少的作用机制之一.
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晚期糖基化终末产物对肠道L细胞凋亡及增殖活性的影响
目的：探讨晚期糖基化终末产物（AGEs）对肠道L细胞株GLUTag细胞凋亡及细胞增殖活性的影响。方法肠道L细胞株GLUTag细胞由加拿大多伦多大学Druker实验室惠赠。将GLUTag细胞株分5组：空白对照组，牛血清白蛋白（BSA）对照组，AGEs 100μg/mL组，AGEs 200μg/mL组，AGEs 300μg/mL组。培养方法：空白对照组，将GLUTag细胞株培养于低糖DMEM中；BSA对照组，将GLUTag细胞株细胞培养于加入BSA的低糖DMEM中；AGEs 100μg/mL组，将GLUTag细胞株培养于终质量浓度100μg/mL AGEs的低糖DMEM中；AGEs 200μg/mL组，将GLUTag细胞株培养于终质量浓度200μg/mL AGEs的低糖DMEM中；AGEs 300μg/mL组，将GLUTag细胞株培养于终质量浓度300μg/mL AGEs的低糖DMEM中；每组细胞均培养24 h。将培养在终质量浓度200μg/mL AGEs中GLUTag细胞株分别培养0、12、24、48 h（即4组）。各组细胞干预结束后采用双染细胞凋亡检测方法检测细胞凋亡率；Hoechst33258荧光染色观察细胞形态；细胞计数试剂盒检测细胞增殖活性。结果各组细胞经药物干预24 h后，AGEs 100μg/mL组、AGEs 200μg/mL组、AGEs 300μg/mL组凋亡细胞百分率明显升高，均显著高于空白对照组和BSA对照组，且AGEs 300μg/mL组凋亡细胞百分率高（P=0.000）。 AGEs 200μg/mL作用12、24、48 h后凋亡细胞百分率显著高于阴性对照组（作用0 h），且作用48 h凋亡率高（P=0.000）。100、200、300μg/mL AGEs作用GLUTag细胞24 h后，细胞活性光密度（OD）值显著低于空白对照组和BSA对照组，且AGEs 300μg/mL组OD值低（P＜0.05）。 AGEs 200μg/mL作用12、24、48 h后细胞OD值显著低于阴性对照组（作用0 h），其中48 h组OD值低（P＜0.05）。结论 AGEs对肠道L细胞株GLUTag细胞的凋亡及增殖活性均产生影响，其细胞凋亡率在相同作用时间下随着AGEs的浓度增高而增多，且在相同剂量下随着AGEs的作用时间延长而增多。 AGEs可诱导肠道L细胞凋亡，抑制细胞增殖活性，从而损伤肠道L细胞。
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黄蜀葵花中5种黄酮类化合物对肠道L细胞AGEs/RAGE/p38MAPK/NF-κB信号通路的调节作用
目的 探讨黄蜀葵花中5种黄酮类化合物对肠道L细胞AGEs/RAGE/p38MAPK/NF-κB信号通路的调节作用.方法 200 mg·L-1 AGEs作用肠道于L细胞株GLUTag细胞,Western blot检测细胞中RAGE、p22Phox、p47Phox、p53、Bax蛋白的相对表达量,ELISA法检测TNF-α、IL-1、IL-6、caspase-3、caspase-9的含量.实验分为7组:空白对照组(NG)、模型组(AGEs)、槲皮素组(QT)、异槲皮苷组(IQT)、金丝桃苷组(HY)、槲皮素-3′-O-葡萄糖苷组(QG)、棉皮素-8-O-葡萄糖醛酸苷组(GG).NG细胞培养于DMEM低糖培养基中;AGEs细胞培养于含200 mg·L-1 AGEs的DMEM低糖培养基中;给药组细胞分别培养于含50 μmol·L-1各黄酮单体及含200 mg·L-1 AGEs的DMEM低糖培养基中.各组细胞经药物干预24 h后,Western blot检测细胞中RAGE、p22Phox、p47Phox、p53、Bax、p-p38MAPK、NF-κB蛋白的相对表达量,ELISA法检测TNF-α、IL-1、IL-6的含量及caspase-3、caspase-9的活性.结果 模型组细胞中RAGE、p22Phox、p47Phox、Bax、caspase-3、caspase-9、Phospho-p38MAPK、NF-κB相对表达量及细胞上清液中TNF-α、IL-1、IL-6的分泌量明显上调(P<0.01),p53相对表达量明显下调(P<0.01).50 μmol·L-1槲皮素、异槲皮苷、金丝桃苷、槲皮素-3′-O-葡萄糖苷、棉皮素-8-O-葡萄糖醛酸苷分别给药后,各蛋白的相对表达量及炎症因子的分泌量接近正常组.结论 黄属葵花中5种黄酮类化合物能明显抑制肠道L细胞AGEs/RAGE/p38MAPK/NF-κB信号通路.
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糖基化终末产物对肠道L细胞株胰高血糖素肽－1分泌水平及L细胞凋亡的影响
目的：探讨糖尿病糖基化终末产物（ AGEs）对肠道L细胞株GLUTag细胞凋亡及胰高血糖素肽－1（ GLP－1）分泌水平的影响。方法200μg／mL AGEs分别作用GLUTag细胞0、12、24、48 h，采用AnnexinⅤ－FITC／PI染色检测细胞凋亡率。利用ELISA检测GLUTag细胞GLP－1分泌水平。实验分5组：空白对照组不加入干预因素，仅培养于DMEM低糖培养基中；BSA对照组培养于加入BSA的DMEM低糖培养基中；AGEs 100μg／mL组培养于100μg／mL AGEs浓度的DMEM低糖培养基中；AGEs 200μg／mL组培养于200μg／mL AGEs浓度的DMEM低糖培养基中；AGEs 300μg／mL组培养于300μg／mL AGEs浓度的DMEM低糖培养基中，分别作用细胞24 h。采用AnnexinⅤ－FITC／PI染色检测细胞凋亡率。利用ELISA检测GLUTag细胞GLP－1分泌水平。结果各组细胞经药物干预24 h后，100、200、300μg／mL AGEs组的细胞凋亡率均显著高于空白对照组和BSA对照组（ P＝0.000）；且300μg／mL AGEs组的细胞凋亡率高（P＜0.05），100、200、300μg／mL AGEs组的细胞分泌GLP－1浓度显著低于空白对照组和BSA对照组（P＝0.000），且300μg／mL AGEs组低（P＜0.05）。200μg／mL AGEs作用12、24、48 h后的细胞凋亡率显著高于BSA对照组（P＝0.000），且作用48 h组凋亡率高（P＝0．000）；200μg／mL AGEs作用12、24、48 h后的细胞分泌GLP－1浓度均显著低于BSA对照组（P＝0．000）；且作用48 h低（P＜0.05）。结论肠道L细胞株GLUTag细胞的凋亡在相同作用时间下随着AGEs的浓度升高而增多，且在相同剂量下随着AGEs的作用时间延长而增多。 AGEs可呈剂量、时间依赖性诱导肠道L细胞凋亡，并显著降低L细胞分泌GLP－1的能力。
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糖基化终产物通过其受体激活NADPH氧化酶及其下游通路诱导L细胞的凋亡
目的:探讨糖基化终产物(AGEs)与其受体(RAGE)及其下游信号通路在肠道L细胞(GLUTag)凋亡中的作用.方法:首先将不同浓度的AGEs作用于GLUTag细胞24 h后,RT-PCR及Western blot检测各组细胞RAGE mRNA及蛋白表达水平.然后将细胞分为BSA对照组、AGEs 200 μg/mL组、AGEs+ siRNA-RAGE组、AGEs+apocynin组.采用AnnexinV-FITC/PI检测细胞凋亡率,荧光探针检测细胞内活性氧水平,Western blot检测NADPH氧化酶亚单位p22phox、p47pbox磷酸化水平和Bcl-2、Bax蛋白表达水平.结果:AGEs干预后GLUTag细胞RAGE mRNA及蛋白表达水平呈剂量依赖性增加.AGEs单独处理组与BSA对照组相比,细胞凋亡率显著增加,NADPH氧化酶亚单位p22phox、p47phox的表达增多,细胞内ROS水平升高,促凋亡蛋白Bax表达上调,抗凋亡蛋白Bcl-2表达下调.AGEs+apocynin组、AGEs+siRNA-RAGE组与AGEs单独处理纽相比,细胞凋亡率显著下降,NADPH氧化酶亚单位p22phox、p47phox的表达减少,细胞内ROS水平下降,促凋亡蛋白Bax表达下调,抗凋亡蛋白Bcl-2表达上调.结论:AGEs作用于GLUTag,可上调细胞RAGE受体表达,激活NADPH氧化酶,使细胞内ROS生成增多,进而通过p53/Bax途径诱导GLUTag凋亡.
