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利用激光显微切割技术提取高质量RNA
RNA的提取是许多实验研究的第一步,也是一个非常重要的环节.而获得高质量的RNA,又是后续实验进展顺利及结果可靠的有力保障.在以往对肿瘤的研究中我们大多以整块组织为研究对象,但众所周知肿瘤组织中不仅含有肿瘤成分还有间质细胞、炎细胞等成分;有些肿瘤组织还具有异质性的特点,即包含了肿瘤进展不同阶段的病变.这些都造成提取出的RNA不"纯",从而导致研究结果出现一定的偏差.还有些研究以培养的肿瘤细胞为实验材料,虽然部分地解决了细胞单一性的问题,但是细胞在培养过程中是否存在某些附加的突变从而影响实验结果却是值得考虑的.因此如何获取纯净的、高质量的RNA成为亟待解决的问题.1996年美国国立癌症研究所开发出了激光捕获显微切割(laser capture microdissection,LCM)技术[1].这是一项在显微镜下从组织切片中分离单一类型细胞群或单个细胞的技术.该技术成功地解决了组织中的细胞异质性问题,是肿瘤学及分子病理学研究的一项革命性技术.
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不同乙醇预处理方式对LMD分离牙胚组织总RNA完整度的影响
目的:探求不同乙醇预处理方式是否对激光显微切割(Laser microdissection,LMD)技术分离获得的小鼠牙胚组织总RNA完整度有影响.以提高LMD技术获取样品的完整度,使之满足后续基因芯片等高通量实验对样品的质检要求.方法:本实验按照LMD切割前是否乙醇预处理的方式分为无预处理LMD组、梯度乙醇处理组以及100％乙醇处理组三组.以LMD技术获取胚胎17天(Embryonic 17,E17)和出生后2天(Postnatal 2,PN2)两时期CD1小鼠下颌第一磨牙的牙胚组织；提取各组总RNA,再以核糖体RNA 28s/18s比值、RNA完整度数值(RNA Integrity Number,RIN),以及样品电泳图的图形来综合判断样品完整度.数据进行统计分析.结果:100％乙醇处理组,RIN值高且与另两组相比差异有显著性,梯度乙醇处理组RIN值与无预处理LMD组相比,并无显著性差异；以28s/18s比值为指标,100％乙醇预处理组高于其它两组,但差异并无显著性;梯度乙醇处理组与无预处理LMD组间差异亦无统计学意义.结论:100％乙醇直接处理方式更适合用于LMD切割样品的防降解预处理,可显著减少切割过程中的组织RNA完整度破坏.该步操作将有利于获得符合高通量实验质检标准的芯片实验样本.
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激光显微切割技术在甲基化水平检测中的应用
睾丸特异性蛋白质50 TSP50是利用甲基化敏感差分析技术(MS-RDA技术)从睾丸和乳腺癌组织中分离出来的低甲基化片段.其表达的TSP50蛋白质与丝氨酸蛋白酶具有同原性.通过免疫组织化学技术证明了TSP50的产物特异性表达在乳腺癌中,而正常乳腺组织中则不表达.本文利用激光显微切割技术及重亚硫酸盐基因组DNA 序列法检测正常乳腺组织和乳腺癌组织中TSP50启动子区域甲基化位点的甲基化状态,阐述TSP50乳腺癌组织中表达的机制.
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结肠癌中心和边缘组织增殖能力的差异及相关基因的表达
目的探索结肠癌组织不同区域肿瘤细胞是否存在增殖能力的差异,且这种区域性差异和多重抑癌基因p16及其可变读码框架p14基因的表达情况及其甲基化状态的相关性.方法免疫组化法测定癌块不同区域增殖蛋白Ki67和P16、P14的表达差异,激光显微切割技术结合甲基化特异性PCR、巢式逆转录PCR观察同一癌块不同区域癌细胞p16及p14基因甲基化状态的改变及其mRNA的表达情况.结果在42份癌组织标本的中心,增殖蛋白Ki67均呈强阳性表达,而P16和P14蛋白表达缺失;在癌组织标本的边缘,有13份Ki67表达阳性(30.1%).不同区域癌细胞的增殖能力差异有统计学意义(P＜0.05),且与年龄、性别、Dukes分期、p14的表达无关,但与p16的表达显著相关(χ2=25.37,P＜0.01).且p16基因的甲基化状态和mRNA的表达也存在明显的区域性差异(P＜0.05).结论人结肠癌组织中存在肿瘤细胞增殖能力的区域性差异,在癌组织边缘肿瘤细胞侵袭力增强的同时增殖能力下降,癌边缘区p16基因去甲基化后的再表达可能是这一细胞事件的分子原因.
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不同RNA抽提方法对激光显微切割分离小鼠牙胚样品总RNA浓度及完整度影响的研究
目的 观察不同RNA抽提方法对激光显微切割(laser microdissection,LMD)分离牙胚样品总RNA浓度及完整度影响.方法 本实验按照RNA抽提的不同方式分为试剂盒组、经典Trizol法组以及改良Trizol法组.以LMD技术获取胚胎17d(embryonic 17,E17)和出生后2 d(postnatal 2,PN2)两时期CD1小鼠下颌第一磨牙的牙胚组织；以3种不同方法提取各组总RNA后再以安捷伦公司的2100生物分析仪所提供的核糖体RNA 28 S/18 S比值(28 S/18 S ratio)、RNA完整度数值(RNA integrity number,RIN),以及样品电泳图的图形来综合判断样品完整度.比较各组RNA的浓度和完整度,以SPSS软件进行统计分析.结果 改良Trizol法所获得RNA浓度高,与其余2组相比,差异均有显著性；经典Trizol法组RNA浓度略高于试剂盒组,但差异并无显著性；3组间以RIN值、28 S/18 S以及样品电泳图的图形为完整度指标进行比较,均无显著性差异.结论 3种RNA抽提方式对样品总RNA获得率和完整度的影响,以改良Trizol法提取的总RNA获得率高,而3种方法对所提取总RNA完整度影响无统计学差异.改良Trizol法将有利于获得符合高通量实验质检标准的芯片实验样本.
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霍奇金淋巴瘤中ΙκΒα基因突变的研究
目的 分析霍奇金淋巴瘤细胞中IκBα基因突变的特点、可能造成的蛋白结构异常,并探讨其分子病理学意义.方法 应用激光显微切割技术分离16例霍奇金淋巴瘤切片中的HRS细胞,并对IκBα基因进行半巢式PCR扩增及DNA直接测序,检测HRS细胞IκBα基因6个外显子突变.结果 16例标本中6例发现IκBα基因突变,突变率为37.5%,突变分别位于1、4、5和6外显子上.其中2例第五外显子出现点突变,形成TGA终止密码子;1例出现第四外显子单碱基缺失突变,形成框移,可造成IκBα蛋白羧基端缺失.霍奇金淋巴瘤背景中反应性淋巴细胞没有发现IκBα突变.结论 霍奇金淋巴瘤IκBα基因突变率为37.5%,高于文献报道(10%~25%).突变可能造成IκBα蛋白的结构异常,通常造成羧基端截短改变.背景中反应性增生的淋巴细胞未发现IκBα基因突变,表明IκBα的基因突变是HRS细胞的特征,并可能在霍奇金淋巴瘤发病机制中起重要作用.
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应用神经逆行示踪及激光显微切割技术精确分离mesostriatal亚群神经元
目的 中脑内向纹状体投射的mesostriatal多巴胺能细胞亚群是导致帕金森病的关键神经元,本实验拟寻找该亚群投射神经元的分布及有效分离方法.方法 利用立体定位技术将绿色荧光逆行示踪剂注射到新生鼠纹状体内,24h后灌注取脑做冰冻切片;应用免疫荧光组织化学染色方法行酪氨酸羟化酶(TH)染色,采用激光显微切割技术将荧光示踪剂标记且呈TH染色阳性的神经元精确切割并收集.结果 荧光示踪的神经元呈TH阳性者即属于mesostriatal亚群神经元,主要分布于中脑黑质,应用激光显微切割技术可精确分离这些逆行示踪且TH染色阳性的神经元.结论 应用逆行荧光示踪和激光显微切割技术可精确分离mesostriatal亚群神经元.
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成牙本质细胞分离技术的新进展
成牙本质细胞分离技术的诞生将牙髓-牙本质复合体研究提高到一个新的水平.成牙本质细胞培养技术、激光显微切割技术和感温预备技术是近年来国外采用的成牙本质细胞分离新技术.本文对以上三种技术的原理、方法、优越性及应用前景作一综述.
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激光显微切割技术的发展和应用
激光显微切割技术是将激光和显微镜结合并用于分离复杂组织中的单一细胞或细胞群的新手段,在分子生物学和病理学等研究中得到了广泛应用.本文就这一技术的原理和应用现状作一综述.
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应用两种激光显微切割系统获取小鼠牙胚特异组织的比较与体会
目的:探索2 种激光显微切割(laser microdissection)系统应用于切割分离小鼠牙胚特定组织的不同特点.方法:以莱卡LMD6000和蔡司PALM激光显微切割系统分别获取CD1小鼠胚胎期17 d和出生后2 d的下颌第一磨牙牙囊和牙乳头组织.以Trizol法提取2 套切割系统获取组织中总RNA,再以RT- PCR法检测两者中管家基因GAPDH表达量的差异.结果:应用莱卡LMD系统获得小鼠下颌第一磨牙牙胚组织中GAPDH基因表达量显著高于以蔡司的PALM系统获得组织中相同基因表达量.莱卡LMD6000激光显微切割系统操作界面友好,切割组织迅速.结论:莱卡LMD6000更适合于下游芯片实验对提取组织RNA完整度较高的要求.
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染色及激光显微切割对小鼠牙胚组织总RNA完整度的影响
目的:观察以常规染色结合激光显微切割(laser microdissection,LMD)技术精确分离获取小鼠牙胚间充质组织对所获得组织总RNA完整度的影响.方法:以LMD技术获取胚胎17 d(embryonic 17,E17)和出生后2 d(postnatal 2,PN2)两时期CD1小鼠下颌第一磨牙的牙囊和牙乳头组织；提取组织总RNA后再以2100生物分析仪所提供的核糖体RNA 28s/18s比值(28s/18s Ratio)、RNA完整度数值(RNA integrity number,RIN),以及样品电泳图的图形来综合判断样品完整度.结果:与未经LMD切割的对照组相比,经染色及LMD切割的实验组所提取牙胚组织样品总RNA完整度明显降低；非染色仅实行LMD组样品总RNA完整度高于染色及LMD组,但其完整度仍低于通常基因芯片实验要求.结论:常规染色及LMD过程对所提取牙胚组织总RNA完整度有显著影响.
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基于GO分析的全基因组芯片筛选小鼠牙囊发育早期差异表达基因的研究
目的:利用基于GO 分析的全基因组芯片技术筛选小鼠牙囊组织在个体发育不同时期的差异表达基因.方法:以激光显微切割技术获取胚胎17 d(E17)和出生后2 d(PN2)两个时期小鼠下颌第一磨牙的牙囊组织后,以改良Trizol法提取总RNA并制备荧光标记的cRNA;然后再以Aglient 小鼠全基因组表达芯片对比分析上述两时期的基因表达差异;后以GeneSpringGX 7.3软件对所得结果进行归一化及倍数筛选,并分别以BioCarta、GenMAPP软件进行基因分类和GO分析.结果:①得到两个发育时期牙囊组织相对于牙乳头组织表达倍数都在10倍以上的一组基因;②得到细胞外基质等10余项常见生物功能相关的基因列表.结论:将激光显微切割以及基因表达芯片两种技术联合可用于小鼠牙周组织发育过程中差异表达基因.
