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石蜡组织转制电镜标本的优化技术
石蜡切片供光学显微镜用于临床病理诊断是一种有效的方法,为了解细胞内更精细的结构,需制作成超薄切片在电子显微镜下观察.我科根据文献提供的方法[1～3]并作适当改进简化,摸索了一种石蜡块改制树脂包埋块的新方法,转制成超微切片,成功用于神经内分泌肿瘤、恶性黑色素瘤等的病理诊断及研究工作.现将此方法简要介绍如下.
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颈淋巴结非干酪坏死性上皮样肉芽肿的病原诊断
对34例颈淋巴结无干酪坏死性上皮样肉芽肿病变，经病理观察、组化，免疫组化和PCR检测进行循环排除定性诊断。对象与方法 一、对象：两院病理科4年内收集34例颈部淋巴结无干酪坏死上皮样肉芽肿，年龄9～46 岁，男20例，女14例。临床诊断非特异炎2例，结核27例，恶性淋巴瘤2例，待查3例，治疗期2～9个月。 二、方法：分组：24例非干酪坏死淋巴肉芽肿为非典型组，7例颈部典型干酪样坏死结核肉芽肿为对照组。2组均常规HE染色及抗酸染色，网状纤维染色及PAS染色。筛选非典型组12例，对照组6例，用ABC法标记鼠抗S100、CD68、MAC-387和CD 57。同时镜下定位石蜡组织块提取肉芽肿区，提取DNA，用PCR法检测TB复合群D NA、EBVDNA和弓形体DNA，并设阴性、阳性对照。
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石蜡组织DNA提取方法的比较
目的:选择一种高效、简便、稳定的从蜡块中提取基因组DNA进行聚合酶链反应(PCR)扩增的方法. 方法:分别采用四种不同的方法从石蜡组织中提取DNA,比较所提取的DNA质量,PCR扩增cyclin D1基因的效率.对其中的一种方法进行了改良. 结果:四种方法提取的DNA质量都能达到相关分子生物学实验的要求,但在操作程序、扩增效率等方面存在差异. 结论:微波脱蜡法操作简单、快速、扩增成功率高,适合于应用PCR技术对病理标本进行相关研究.
关键词： DNA提取 石蜡组织 聚合酶链反应 cyclin D1基因 -
荧光定量PCR检测石蜡组织中结核分枝杆菌
目的 改进石蜡组织的处理,提高结核分枝杆菌在石蜡组织中检测的敏感性.方法 选择荧光定量PCR检测石蜡组织结核分枝杆菌检测结果为临界值的蜡块标本,行HE染色、抗酸染色及荧光定量PCR石蜡组织结核分枝杆菌DNA检测.通过对其石蜡组织少修片、混合多个蜡块、选择干酪样坏死及肉芽肿病变较多的蜡块以及适量增加模板量的多种方法,对比其在荧光定量PCR法中的检出率.结果 各实验组Ct值减小,扩增曲线均有不同程度的升高.结论 改进操作措施后可以提高蜡块中结核分支杆菌检测的敏感度.
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ALK基因FISH检测失败的补救方法
随着分子病理学和个体化靶向治疗的发展， FISH技术作为分子诊断的主要工具，应用越来越广泛和普及。 FISH技术由于其具有检测ALK变异体类型的全面性，经FDA批准，用于临床非小细胞肺癌靶向用药人群的筛选。肺穿刺石蜡组织标本经过几轮切片(常规HE、免疫组化、EGFR突变检测)，所剩组织只能切出为数不多的适合FISH (切片可计数细胞>50个)实验的切片，如果FISH实验失败，几乎不可能重新切片；外院会诊的病例也存在无法重新获得白片的情况。因此，作者直接将FISH实验失败的片子重新处理，加探针，得到比较满意的结果，现介绍如下。
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利用相差显微镜观察FISH检测石蜡包埋组织切片的理想酶消化程度
自1969年发展至今FISH检测技术操作程序得到了极大简化[1],临床病理科已广泛应用.石蜡包埋组织切片的FISH检测流程中,酶消化是关键步骤.理想的酶消化状态是获得清晰易判读的杂交信号.然而国内大多数实验室在判断酶消化是否达到理想状态尚缺乏简便有效的手段.许多工作人员根据文献报道或试剂盒推荐估计酶消化时间,在酶消化后染DAPI于荧光显微镜下观察消化是否达到理想状态,既浪费荧光染料又增加了汞灯的损耗,且操作烦琐.而事实上国外实验室FISH检测已多采用相差显微镜来判断酶的消化程度.本文现就采用相差显微镜观察判断FISH检测石蜡包埋组织切片的酶消化程度的有效性作一探讨.
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乳腺癌石蜡组织FISH检测预处理方法
目前有关乳腺癌HER2/neu基因检测的标本主要是石蜡组织.在进行FISH检测中,石蜡切片的预处理至关重要,主要是降低细胞核周围非特异性荧光背景并使细胞核充分暴露.在预处理环节中,需用90 ℃水浴或50 ℃酸性亚硫酸钠处理切片,蛋白酶K适当消化处理.一般认为预处理的关键在于蛋白酶K的消化时间,但对固定、脱水不好或间质成分较多的组织,细胞核周围杂质较多,显微镜下观察自发荧光过强,消化时不易控制消化程度,很难降低高背景荧光带来的干扰,细胞核容易形成空洞.本研究在酶消化前采用pH 9.0 EDTA水溶液煮沸的处理方法来代替90 ℃水浴或50 ℃酸性亚硫酸钠,取得满意效果,现介绍如下.
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介绍一种HPV检测的石蜡组织取样方法
现已证实,部分高危型HPV感染具有潜在致癌性,能引起外生殖器癌、宫颈癌及高度子宫颈上皮内瘤.低危型HPV主要引起肛门皮肤及男性外生殖器、女性大小阴唇、尿道口、阴道下段的外生性疣类病变和低度子宫颈上皮内瘤.目前,HPV分型的检测方法主要有杂交法和以聚合酶链式反应(polymerase chain reaction, PCR)为基础的两大类[1].临床检测大多选择PCR法.在PCR检测中,取样一般为黏膜生殖道病变上皮层细胞或皮肤疣状物上皮刮取物,用棉签或无菌小毛刷轻拭病变部位即可采集到足够的脱落细胞做DNA提取[2].在基础研究和临床研究中常常需要用皮肤或宫颈的石蜡组织做HPV检测,在检测中对石蜡包埋组织取样大多数采用切片机切片,有的将组织切成小卷装在EP管中,有的将切好的组织裱贴在玻片上,然后经过脱蜡等过程处理后才能进行组织DNA的提取,过程繁琐,还容易造成样本的污染.现介绍一种简单方便的石蜡组织取样方法.
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短扩增子对结直肠癌转移石蜡组织LncRNA定量分析的可行性
目的 探讨短扩增子对结直肠癌转移石蜡包埋组织(以下称石蜡组织)长链非编码RNA(LncRNA)定量分析的可行性.方法 筛选与结直肠癌转移相关的4条LncRNA (LncRNA-Enst00000554679、LncRNA-Enst00000550851、LncRNA-Enst00000497498、LncRNA-Enst00000513016).收集结直肠癌石蜡组织55例份、结直肠癌冰冻组织40例份,每份标本包含结直肠癌组织、癌旁正常组织和转移淋巴结组织.采用实时荧光定量PCR法检测25例份冰冻组织中结直肠癌组织、癌旁正常组织、转移淋巴结组织4条长扩增子扩增后LncRNA表达.设计4条LncRNA的短扩增子引物,评估长、短扩增子在冰冻组织和石蜡组织中的扩增效率及测定系数(R2).分析冰冻组织中短扩增子和长扩增子的定量一致性以及冰冻组织和石蜡组织短扩增子的定量一致性.分别为4条LncRNA设计3对短扩增子引物,分析石蜡组织中3个短扩增子的定量一致性.结果 癌旁正常组织、结直肠癌组织、转移淋巴结组织4条LncRNA相对表达量逐渐升高(P均<0.05).短扩增子在冰冻组织和石蜡组织中均能达到佳扩增效率,而长扩增子均未达到佳扩增效率,短扩增子的R2明显高于长扩增子(P<0.05).在冰冻组织中短扩增子和长扩增子的定量一致性为62.5％;冰冻组织与石蜡组织短扩增子的定量一致性仅为25.0％.4条LncRNA中3个短扩增子扩增循环数变化趋势一致率为37.5％,2个短扩增子扩增循环数变化趋势一致率达到100％.结论 筛选的4条LncRNA在结直肠癌转移组织中表达升高;使用短扩增子对石蜡组织LncRNA进行定量分析是可行的.
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食管癌DNA倍体分析方法探讨
目的 探讨不同方法检测DNA倍体结果的一致性及可靠性.方法 分别采用单细胞制备仪、组织匀浆器及石蜡组织提取DNA标本,通过流式细胞仪同时检测56例食管癌DNA倍体.结果 采用单细胞制备仪、组织匀浆器及石蜡组织提取DNA标本,56例食管癌非整倍体率分别为48.21％、44.64％和42.86％,其中各有1例为近二倍体.采用石蜡组织法检测DNA倍体SPF值为(18.205±7.719)％,高于组织匀浆器提取法的(17.330±8.160)％和单细胞制备仪提取法的(15.479±7.811)％,但差异无统计学意义(t=0.583、1.858,P=0.561、0.066);组织匀浆器提取法SPF值高于单细胞制备仪提取法,但差异无统计学意义(t=1.227,P=0.223).结论 不同方法检测DNA倍体SPF值差异不具有统计学意义,采用单细胞制备仪方法检出非整倍体率高,可能为佳检测DNA倍体的方法.
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IgH不同区域基因重排引物的分析及在石蜡淋巴瘤诊断中的应用
目的 通过生物信息学方法分析并优化免疫球蛋白重链(IgH)不同框架(FR)区域基因重排的引物,探索其对石蜡包埋的淋巴瘤组织基因重排检测中的应用.方法 通过Clustal W 软件比较44条有效的lgH可变区和6条J区的基因片段,选取3对(IgH FR1、FR2、FR3区各一对,分别为P1c,P2A,P31)IgH基因重排引物作为B细胞基因重排引物.另选一对TCRγ引物作为T细胞基因重排引物.通过PCR扩增,检测经形态学及免疫组织化学确诊的101例(80例B细胞淋巴瘤、14例T细胞淋巴瘤和7例淋巴结反应性增生组织)石蜡包埋组织标本的基因重排状况.以DG75、Jurkat淋巴瘤细胞系DNA作为B和T细胞淋巴瘤基因重排的阳性对照,以反应性增生组织DNA作为阴性对照.结果 IgHFR1、FR2和FR3区域引物对80例B细胞淋巴瘤的阳性检出率分别为37.5%(30/80)、52.5%(42/80)和70.0%(56/80),在14例T细胞淋巴瘤中均为7.1%,三者的检出率两两之间差异有显著性;IgH FR3区和lgH FR2区引物的组合可将其检出率提高到83.9%.以上引物在7例反应性淋巴结中均未检出阳性.结论 IgH不同区域引物比较.FR3区引物检出率明显高于FR1区和FR2区.FR3区和FR2区引物联合检测可明显提高石蜡组织中B细胞淋巴瘤基因重排的检出率.
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Chelex-100法快速提取石蜡组织中EB病毒基因组DNA
目的:以鼻咽癌石蜡组织为材料,用Chelex-100法提取鼻咽癌组织中EB病毒基因组DNA,并以此为模板扩增出EBNA-3C片段,以建立快速提取石蜡组织中EB病毒基因组DNA的方法.方法:应用原位杂交方法检测30例鼻咽癌石蜡切片组织中EB病毒编码的小RNA(EBER)的情况,应用Chelex-100法快速提取鼻咽癌组织中EB病毒基因组DNA,并以此为模板用PCR扩增出EBNA-3C片段.结果:(1)30例鼻咽癌石蜡组织中原位杂交检测EBER全为阳性.(2)用Chelex-100法从30例鼻咽癌石蜡组织中提取了EB病毒基因组DNA并成功扩增出EBNA-3C片段.结论:Chelex-100法是快速提取鼻咽癌石蜡组织中EB病毒基因组DNA的高效方法.
关键词： 鼻咽肿瘤 石蜡组织 EB病毒 Chelex-100 -
会诊HE切片脱色后再行特殊免疫组化染色的方法与体会
近年来,我院病理科接收来院会诊的疑难病例越来越多,部分远途来院会诊者有时仅带HE切片,而未带其他能进一步做病理检查的石蜡组织块,往往许多会诊病例仅仅靠一张HE切片很难作出准确的诊断,需要做免疫组化染色.但一些远途来我科会诊的患者或家属,返回原就诊医院借蜡块既不方便,又延误患者的及时诊治,并增加经济负担.作者在工作中经过长期反复实验、摸索,尝试了在21例会诊HE切片上同时做免疫组化染色,既能保留原HE切片,又增加了免疫组化染色.此方法简单易行,对快速、准确的会诊诊断起到了积极有效的作用.现将我们的具体操作方法及体会报道如下.
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抗原修复方式及修复液pH值对免疫组化染色的影响
在做石蜡组织免疫组化时,多数切片需做抗原修复,修复方式常用的是热修复,抗原修复液多为pH 6.0枸橼酸盐缓冲液和pH 9.0 Tris-EDTA缓冲液,我们选用不同的热修复方式和常用的两种修复液进行比较,以观察它们对免疫组化染色结果的影响,希望能找到有效的、稳定的、相对统一的抗原修复方法.
