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胃癌组织中cyclin D1 P16和Rb蛋白表达的意义
正常细胞周期中,cyclin D1(细胞周期蛋白D1)与CDK4(细胞周期蛋白激酶)结合形成复合物促进细胞分裂增殖,p16和Rb抑制细胞分裂,从而保证机体细胞的正常生长.当这一促增生系统成分过表达以及抑制增生系统成分缺失或失活都会导致细胞增殖失控而发生癌变.研究表明许多肿瘤中均有cyclinD1的过度表达及p16 Rb基因的缺失[1-5].我们用免疫组化方法检测了30例胃癌标本中cyclin D1,P16和Rb蛋白的表达,并与手术切缘正常粘膜组织进行比较,旨在探讨三者的相关性及其在胃癌形成中的作用.
关键词： 胃肿瘤 免疫组织化学 cyclin D1基因 p16基因 RB基因 -
原发性肝细胞癌中cyclin D1基因表达与P16 及CDK4蛋白表达的关系
目的研究cyclin D1基因在原发性肝细胞癌中的表达,并探讨其与P16及CDK4蛋白表达的关系.方法用原位杂交检测cyclin D1基因mRNA表达,免疫组化检测Cyclin D1蛋白表达.结果 6例(14.3%)HCC可检测到cyclin D1基因过表达,5例属Ⅲ-Ⅳ级,1例属Ⅱ级.6例HCC均有CDK4蛋白表达,其中3例为P16蛋白阳性.结论①cyclin D1表达增加只在小部分恶性程度高的HCC中起作用,可能与肿瘤侵袭有关.②在HCC中,cyclin D1基因过表达和(或)P16蛋白丢失均起重要作用.
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幽门螺杆菌对人胃上皮细胞β-catenin蛋白信号途径影响意义的研究
目的:探讨幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,H.pylori)裂解液对人胃上皮GES-1细胞β-catenin蛋白信号途径及其下游靶基因Cyclin D1和c-myc表达,以及对细胞增殖的影响.方法:用H.pylori超声裂解液处理GES-1,免疫荧光法和蛋白质印迹法检测β-catenin蛋白亚细胞定位以及核内蛋白表达量的变化；荧光定量聚合酶链反应(quantitativepolymerase chain reaction,QRT PCR)检测Wnt/β-catenin蛋白信号下游靶基因Cyclin D1和c myc基因mRNA表达水平的变化；MTT法检测细胞的增殖.结果:H.pylori裂解液处理人胃上皮GES-1细胞后,H.pylori处理组引起了β-catenin蛋白从细胞膜至细胞质以及细胞核内的移位,呈时间依赖性.蛋白质印迹法检测结果证实,与对照组相比,H.pylori处理组在12、24 h分别引起了细胞核内β-catenin蛋白表达量的增加,分别为0.31±0.05和0.55±0.04,P值均＜0.01.QRT-PCR检测发现,与对照组相比,H.pylori处理组12 h c-myc基因表达量没有变化,F=0.338,P＞0.05;而24 h的表达量明显增高,F=39.290,P＜0.01;H.pylori处理组12 h Cyclin D1基因表达量明显增高,F=72.567,P＜0.01；而24 h的表达量虽然增高,但是差异无统计学意义,F=2.368,P=0.175;且明显低于12h的表达量,F=37.468,P＜0.01.MTT法检测显示,5μL的H.pylori裂解液处理细胞12、24和36 h的增殖抑制率分别为-13.3％、28.5％和 62.5％;10μL的分别为-24.1％、-58.0％和-87.9％;20 μL的分别为-39.8％、-131.3％和-165.2％.结论:H.pylori裂解液异常激活了β-catenin蛋白信号途径,促进β-catenin蛋白向细胞核内移位,通过上调其下游靶基因cyclin D1和c myc的mRNA表达,促进细胞增殖,其效应呈时间以及浓度依赖.
关键词： 幽门螺杆菌 β-catenin cyclin D1基因 c-myc基因 细胞增殖 -
应用Cyclin D1和bcl-2靶标的siRNA慢病毒载体构建和鉴定
背景:近年来,与骨肉瘤耐药相关的基因研究大多局限于单个基因或单个通路.而进行细胞凋亡和细胞周期调控双通道同时阻断有可能逆转药物耐受机制.目的:构建bcl-2和cyclin D1特异性siRNA慢病毒载体,拟将其转入骨肉瘤耐药细胞株,探讨对骨肉瘤耐药性的逆转作用.方法:采用限制性内切酶酶切、T4DNA连接酶连接等方法,将bcl-2和cyclin D1基因分别插入慢病毒载体pSIH1-H1-copGFP shRNA Vector中,构建bcl-2和cyclin D1与pSIH1-H1-copGFP共表达的慢病毒载体(pSIH1-H1-copGFP-bcl-2-siRNA和pSIH1-H1-copGFP-cyclinD1-siRNA).构建成功后的慢病毒质粒系统和pPACK包装质粒共转染293T细胞,过滤,浓缩病毒,利用荧光蛋白作为报告基因,对病毒滴度和感染效率进行检测.结果与结论:4对bcl-2和cyclin D1特异性siRNA与双酶切慢病毒载体pSIH1-H1-copGFP shRNA Vector连接成功.共转染293T细胞包装病毒并浓缩后滴度达1.14×104 jfu/μL,适合感染目的细胞.实时荧光定量PCR检测结果显示对bcl-2和cyclinD1基因的干扰效率高分别达88%和87%.证实将siRNA技术应用于bcl-2和cyclin D1,能够构建出有效的bck2和cyclin D1特异性siRNA慢病毒载体.
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p16、cyclin D1在原发性肺癌的表达及其临床意义
目的:观察并探讨p16、cyclin D1基因在原发性肺癌组织中的表达水平及其与肿瘤病理生物学行为等的关系.方法:采用S-P免疫组化方法检测68例原发性肺癌标本中p16、cyclin D1蛋白的表达.结果:原发性肺癌中p16蛋白表达阳性率显著低于癌旁组织(P＜0.05);cyclin D1在原发肺癌中的阳性率显著高于癌旁组织(P＜0.05).二者表达与肿瘤大小、淋巴结转移、病理分级及疾病分期密切相关(P＜0.05),且二者表达显著负相关(P＜0.05).结论:在原发型肺癌中存在抑癌基因p16编码蛋白的表达下调以及原癌基因cyclin D1表达上调,与肿瘤的进展密切相关.提示二者可能通过影响细胞周期调控在肺癌的发生发展过程中起重要作用.
关键词： p16基因 cyclin D1基因 原发性肺癌 蛋白表达 -
9-顺维甲酸诱导肺癌细胞凋亡的流式细胞术检测
Rb基因是一种抑癌基因,cyclin D刺激CDK4介导Rb的磷酸化作用而导致细胞转化.维甲酸类化疗药物作为分化诱导剂可诱导调控细胞凋亡,而9-顺维甲酸(9-cis RA)的生物学活性强于其他维甲酸类化合物[1-2].本实验运用流式细胞技术检测细胞内cyclin D1及Rb的表达率,并通过细胞周期倍体分析,观察其凋亡的发生率,探讨9-cis RA诱导肺癌细胞株凋亡与cyclin D1和Rb表达的相关关系,为9-cis RA临床治疗肺癌提供实验依据.
关键词： 9-顺维甲酸 细胞凋亡 cyclin D1基因 RB基因 流式细胞术 -
Rho A蛋白通路在DLC-1基因调控人结肠癌HT29细胞周期中的作用及其机制
目的: 探讨Rho A蛋白通路在DLC-1(frequently deleted in liver cancer-1)基因调控人结肠癌HT29细胞周期中的作用及其机制.方法: 构建pcDNA3.1-DLC1质粒载体,脂质体法转染HT29细胞,筛选稳定细胞系;pull-down方法分析Rho A蛋白活性;实时定量PCR检测细胞周期相关蛋白Cyclin D1、p21的表达变化;流式细胞仪检测细胞周期分布.结果: 野生型人结肠癌HT29细胞DLC-1基因表达呈阴性,经转染获得DLC-1稳定表达细胞系.与野生型及空载组HT29细胞相比,转染组细胞Rho A蛋白活性下降;Cyclin D1表达下调, p21表达上调;G1期及凋亡细胞数增加,而G2期细胞数下降.结论: 转染DLC-1基因引起人结肠癌HT29细胞Rho A蛋白活性下调,进而可能通过对Cyclin D1、p21表达的调控使细胞周期G1期阻滞并诱导凋亡,同时分裂前期细胞数减少,细胞增殖受抑.
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石蜡组织DNA提取方法的比较
目的:选择一种高效、简便、稳定的从蜡块中提取基因组DNA进行聚合酶链反应(PCR)扩增的方法. 方法:分别采用四种不同的方法从石蜡组织中提取DNA,比较所提取的DNA质量,PCR扩增cyclin D1基因的效率.对其中的一种方法进行了改良. 结果:四种方法提取的DNA质量都能达到相关分子生物学实验的要求,但在操作程序、扩增效率等方面存在差异. 结论:微波脱蜡法操作简单、快速、扩增成功率高,适合于应用PCR技术对病理标本进行相关研究.
关键词： DNA提取 石蜡组织 聚合酶链反应 cyclin D1基因 -
Cyclin D1基因沉默对K562细胞增殖及凋亡的影响
[目的]利用RNA干扰(RNAi)技术观测其对白血病K562细胞cyclin D1基因的沉默效应及对细胞增殖、细胞周期及凋亡的影响.[方法]体外构建靶向cyclin D1基因的小发夹RNA(shRNA)表达质粒,通过壳聚糖介导转染K562细胞,Western blot分析检测转染前后cvclin D1蛋白表达变化;集落形成实验检测细胞增殖能力;流式细胞仪检测细胞周期分布及凋亡情况.[结果]构建靶向cyclin D1基因的shRNA表达质粒(pshRNA-419和pshRNA-575)经壳聚糖转染后,能显著抑制cyclin D1基因表达;抑制K562细胞增殖,影响其集落形成能力;细胞阻滞于G0/G1期,细胞凋亡明显.而m-pshRNA-790质粒并无上述生物学效应.[结论]cyclin D1基因表达下调可抑制K562细胞生长,影响细胞周期分布,并诱导细胞凋亡.提示cyclin D1基因可能是白血病治疗的一个有效靶点.
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RNA干扰沉默CyclinD1基因对胰腺癌AsPC-1细胞增殖和凋亡的影响
目的 探讨以细胞周期蛋白(Cyclin) D1为靶基因的RNA干扰对胰腺癌AsPC-1细胞增殖和凋亡的影响,为胰腺癌的靶向治疗提供依据.方法 用含有10％ FBS的DMEM培养液在37℃、5％CO2培养箱中常规培养AsPC-1细胞,至对数生长期后接种于96孔培养板中,随机分为实验组、阴性对照组、空白对照组,并采用LipofectamineTM2000脂质体分别转染Cyclin D1-小干扰RNA(siRNA)、阴性对照siRNA、脂质体,48 h时收集细胞.应用荧光定量PCR法和Western blot法分别检测细胞中Cyclin D1 mRNA和蛋白表达水平,MTT法检测细胞体外增殖活力,流式细胞仪检测细胞周期分布及凋亡率(AI).结果与空白对照组和阴性对照组相比,实验组Cyclin D1 mRNA和蛋白表达均明显下调,细胞生长速度明显减慢,Go/G1细胞比例显著增大、S期细胞比例则明显降低、AI显著升高(P均＜0.01).结论 Cyclin D1-siRNA能通过沉默靶基因表达抑制AsPC-1细胞生长、改变细胞周期分布、诱导细胞凋亡,可作为胰腺癌基因治疗的一个有效靶点.
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人RUNT相关转录因子3、细胞周期素在胰腺癌组织中mRNA水平的表达及其与临床病理因素的关系
目的 探讨人RUNT相关转录因子3(RUNX3)、细胞周期素(Cyclin D1)基因在胰腺癌组织和癌旁组织中mRNA表达水平与临床意义.方法 采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测RUNX3、Cyclin D1基因在42例胰腺癌组织及其癌旁组织中mRNA表达水平,并分析RUNX3、Cyclin D1基因mRNA表达与临床病理因素的关系.结果 (1)RUNX3基因在42例胰腺癌组织中mRNA表达量相对值为:0.2469±0.0708；相应癌旁组织中相对值为:0.7091±0.1764,两者差异有统计学意义(t=15.7036,P＜0.01).(2) RUNX3基因mRNA表达水平在分化程度、淋巴结转移、临床分期等病理因素的差异有统计学意义(P＜0.05),而与性别、年龄等因素无明显相关(P＞0.05).(3) Cyclin D1基因在42例胰腺癌组织中mRNA表达量相对值为:0.7769±0.1456；相应癌旁组织中相对值为:0.2860±0.1224,两者差异有统计学意义(t=18.9158,P＜0.01).(4) Cyclin D1基因mRNA表达水平在分化程度、淋巴结转移、临床分期等病理因素的差异有统计学意义(P＜0.05),而与性别、年龄等因素无明显相关(P＞0.05).(5)胰腺癌中RUNX3基因的mRNA表达抑制与Cyclin D1基因的过表达呈明显相关(r=-0.320,P＜0.05).结论 RUNX3基因在胰腺癌组织中mRNA 表达抑制,Cyclin D1基因在胰腺癌组织中mRNA过表达,RUNX3表达抑制或缺失及Cyclin D1过表达与胰腺癌的发生、发展有关.
关键词： 胰腺癌 RUNX3基因 cyclin D1基因 -
RNA干扰靶向cyclin D1基因对K562细胞化疗增敏的研究
目的 cyclin D1基因在细胞周期调控中起关键性作用.研究表明其过表达与肿瘤的发生、发展及预后密切相关;并且与肿瘤细胞对化疗药物抗拒性有关.抑制Cyclin D1蛋白表达可达到化疗增敏作用.本研究利用RNA干扰(RNAi)技术体外观测其对K562细胞cyclin D1基因的沉默效应及增强阿霉素(ADM)对K562细胞毒性作用.方法 体外构建靶向cyclin D1基因的小发夹RNA(shRNA)表达质粒,通过壳聚糖介导转染K562细胞,Western blot分析检测转染前后Cyclin DI蛋白表达变化,流式细胞仪检测细胞周期分布及凋亡率的影响以及MTT法检测K562细胞对ADM敏感性的变化.结果 构建靶向cyclin D1基因的shRNA表达质粒(pshRNA-419和pshRNA-575)经壳聚糖转染后,能显著抑制cyclin D1基因表达;影响K562细胞周期分布,诱导细胞凋亡,并降低ADM半数抑制浓度,提高了化疗敏感性.而设计一碱基突变的序列所构建的质粒并无上述生物学效应.结论 沉默K562细胞cyclin D1基因表达可达到有效的化疗增敏目的.
关键词： cyclin D1基因 RNA干扰 小发夹RNA K562细胞 化疗敏感性 -
细胞外信号调节激酶信号通路对乙醛刺激的大鼠肝星状细胞周期的影响
目的观察特异性丝裂原细胞外信号反应激酶1(MEK1)阻断剂(PD98059)对乙醛刺激的大鼠肝星状细胞(HSC)增殖及细胞周期的影响,并探讨其作用机制.方法用不同浓度的PD9 8059对乙醛刺激的HSC进行处理;以四甲基偶氮唑蓝法检测细胞增殖,流式细胞仪检测细胞周期,逆转录聚合酶链反应方法检测HSC内细胞周期蛋白-D1(Cyclin D1)mRNA和细胞周期蛋白依赖性激酶(CDK4)mRNA的表达.结果20、50、100 μmol/L的PD98059均能显著且剂量依赖性地抑制乙醛刺激的HSC增殖,3组A值分别为0.109±0.020、0.081±0.010、0.056±0.020,与乙醛组A值0.146±0.030相比较,F=31.385,P＜0.05; 20、50、100 μmol/L的PD98059可显著抑制乙醛刺激的HSC由G1期进入S期,Go/G1期细胞百分比逐渐升高,3组G0/G1期细胞百分比分别为(61.9±6.3)%、(64.1±3.3)%、(70.9±4.8)%,与乙醛组(55.2±4.4)%相比较,F=16.402,P＜0.05; 50、100 μmol/L的PD98059能显著抑制乙醛刺激的HSC内Cylin D1 mRNA表达,2组平均光强度比值分别为0.56±0.04,0.46±0.03,与乙醛组0.65±0.07相比较,F=68.758,P＜0.05; 50、100μmo1/L的PD98059能显著抑制乙醛刺激的HSC内CDK4mRNA表达,2组平均光强度比值分别为0.39±0.07,0.33±0.05,与乙醛组0.50±0.06相比较,F=29.406,P＜0.05.结论细胞外信号调节激酶信号通路是调控乙醛刺激的大鼠HSC增殖及其细胞周期的重要通道,可能与调控Cyclin D1mRNA和CDK4mRNA表达有关.
关键词： 肝纤维化 有丝分裂素激活蛋白激酶类 大鼠 乙醛 肝星状细胞 cyclin D1基因 CDK4基因 -
9-顺维A酸诱导肺癌细胞L78凋亡及其与Rb和Cyclin D1基因表达的关系
目的研究9-顺维A酸(9-cis-retinoic acid, 9-cis RA)诱导肺鳞癌细胞株L78凋亡作用及其与Rb、Cyclin D1基因表达的关系,初步探讨其作用机制. 方法体外培养肺鳞癌细胞株L78,随机分为两组,实验组:加入浓度为5 μmol/L的9-cis RA;对照组:加入浓度为0.1%二甲亚砜.两组均培养48小时后用免疫组织化学法检测L78细胞中Rb基因表达率,用流式细胞仪技术分别检测Rb、Cyclin D1基因表达率和肿瘤细胞凋亡率, 并研究三者之间的相关关系. 结果实验组肺鳞癌细胞株L78细胞Rb基因表达明显增强,Cyclin D1基因表达降低,细胞凋亡率增高(P＜0.01).Rb基因表达率与细胞凋亡发生率呈正相关(r=0.854,P＜0.05),Cyclin D1基因表达率与细胞凋亡发生率呈负相关(r=-0.812,P＜0.05). 结论 9-cis RA可能通过Rb基因表达增强和Cyclin D1基因表达降低途径,使细胞明显阻滞在G0/G1期,并诱导肺鳞癌细胞株L78细胞凋亡.
关键词： 9-顺维A酸 人肺癌细胞株 细胞凋亡 RB基因 cyclin D1基因
