伯氏疟原虫感染早期的根治性治疗对再感染体液免疫应答的影响

为探讨疟疾感染早期根治性治疗对再感染体液免疫应答的影响,用伯氏疟原虫感染DBA/2小鼠,感染后3天进行根治性治疗,并于初次感染后90天再进行感染.通过薄血膜吉姆萨染色法计数红细胞感染率,流式细胞术检测再感染前(0天)和再感染后(1、3、5天)不同时间点脾细胞中活化性B细胞百分率,ELISA检测血清中特异性IgG、IgG1、IgG2a和总IgE水平.结果发现,同源疟原虫再感染后,根治性治疗小鼠仅出现短暂的低水平原虫血症,再感染后第3天活化性B细胞开始明显升高;同时IgG、IgG1和IgG2a也出现有意义的升高,但再感染前,这些小鼠血清IgG、IgG1和IgG2a均明显高于未感染的正常小鼠,IgG2a在每一检测点均显著高于IgG1,血清中总IgE水平于再感染后第1天即出现明显升高.此结果提示,疟疾感染早期的根治性治疗并不影响宿主在再感染时产生有效的体液免疫应答,一些记忆性B细胞和长效浆细胞的存在可能是抵御再感染的关键因素,特异性IgG,尤其是IgG2a的作用或许尤为重要.

体外短期培养可提高伯氏疟原虫成熟裂殖体获得率

在观察了正常状态下ICR小鼠体内伯氏疟原虫PbANKA1596cl1发育特征的基础上,从采血状态、培养环境及时间等多方面优化伯氏疟原虫PbANKA1596cl1 (Pb1596)体外培养方法,增加成熟裂殖体比例,为提高转染效率打下良好基础.当小鼠体内原虫率达到5％ ～ 15％时,经梯度离心富集滋养体期感染红细胞,再用0.01 L小体积完全培养基、缩短培养时间至8～10 h体外培养,观察成熟裂殖体的生长状态及比例.结果表明,与传统方法相比,优化后的体外培养方法在保证细胞90.27％的高存活率同时,有效增加成熟裂殖体的比例从0.97％上升至24.37％ (P ＜0.05),且单个裂殖体平均裂殖子数由13增加至16 (P＜0.05),缩短实验周期至11 ～13 h,并可避免游离裂殖子的流失,从而为进一步的鼠疟转染实验奠定良好基础.

斯氏按蚊产卵前后不同器官对伯氏疟原虫出丝诱导活性的影响

为分析斯氏按蚊产卵与头、唾液腺和卵巢组织中出丝诱导活性动态的相互关系,应用雄配子体体外出丝检测雌性斯氏按蚊产卵前后头、唾液腺及卵巢抽提物对伯氏疟原虫雄配子体出丝诱导活性的动态变化.结果表明:产卵前后各时相点之间-头部抽提物的出丝诱导活性未发生有意义的变化.吸血后1 h内按蚊唾液腺抽提物的出丝诱导活性显著下降,产卵翌日恢复到吸血前水平;卵巢匀浆上清的诱导活性亦在吸血后下降,吸血后第2日显著升高,产卵翌日回落.斯氏按蚊唾液腺和卵巢的出丝诱导活性在产卵后相互消长,这些变化可能与蚊卵的发育、成熟及产出相关.

探究获得高成熟率伯氏疟原虫裂殖体的体外培养条件?

为获得大量有活力的伯氏疟原虫裂殖体，本研究对伯氏疟原虫ANKA虫株的体外培养条件主要从培养基的用量、培养基胎牛血清的含量、培养的细胞浓度、培养时间及培养的气体环境等方面进行了优化。当小鼠体内虫血率达到1％～3％，在红内期疟原虫处于环期或早期滋养体阶段时取血分组培养，观察在不同培养条件下裂殖体的状态并检测其活力。与既往的体外培养方法相比，优化后的培养方法，可将裂殖体的成熟率提高到80％，每个裂殖体含12～16个裂殖子，裂殖体尾静脉注射重新入侵红细胞4 h后的虫血率为1?57％，与对照组相比裂殖体的活力提高3?4倍。优化的方法可以提高裂殖体的得量和活力，为伯氏疟原虫的转染奠定基础。

磷酸萘酚喹与青蒿素伍用增效和延缓疟原虫抗药性的研究

本文采用鼠疟模型进行磷酸萘酚喹与青蒿素伍用的药效学研究.用正交设计和4天抑制试验法,研究两药伍用增效的适配比.采用药物剂量递增培育抗性的方法,连续血传100代,分别培育鼠疟原虫对磷酸萘酚喹、青蒿素及两药伍用的抗药性.结果显示磷酸萘酚喹和青蒿素适配比为1:50,对鼠疟敏感株和抗氯喹株的增效指数分别为4.2和8.2,杀虫速度和治愈率均优于单药.培育至100代时,磷酸萘酚喹、青蒿素和两药伍用抗性指数分别为200.3、5.6和4.4.结果表明,磷酸萘酚喹与青蒿素配伍具有增效作用.并能明显延缓疟原虫对单药抗性产生的速度.降低抗性水平.

青蒿化学成份及其与青蒿素伍用对鼠疟的药效学研究

实验采用鼠疟模型及Peters 4天抑制试验法,对从青蒿中分离得到的主要化学成份及其与青蒿素伍用进行了药效学评价.结果显示,青蒿素(QHS)的ED50和ED90分别为(10.2±1.3)mg/kg/d和(29.0±2.7)mg/kg/d.将青蒿素、青蒿酸、青蒿乙素、东莨菪内酯按1:1:1:1混合得到QHH,其ED50和ED90分别为(12.6±1.1)mg/kg/d和(47.0±5.7)mg/kg/d.青蒿酸(QHA)、青蒿乙素(QHB)、东莨菪内酯(QHC)、青蒿黄酮1(QHD)、青蒿黄酮2(QHE)5种成份对鼠疟均有不同程度的抑制作用,但剂量高达500 mg/kg/d时,抑制率高也仅达到59%,远低于QHS的疗效.将分离的5种成份分别与QHS的半数有效剂量配伍进行药效测定,仅QHC的高剂量组显示一定的协同作用,其他各个组均未显示增效.QHH中QHS仅占1/4,但对鼠疟药效测定的结果ED50和ED90的值与QHS相近,提示QHA、QHB、QHC混合成份对QHS有一定的协同作用.因此,传统中药青蒿对疟疾的疗效是由以青蒿素为主的多组份共同作用的结果.

卡介苗接种对小鼠伯氏疟原虫感染早期树突状细胞活化状态的影响

为观察疟原虫感染早期卡介苗(BCG)接种对小鼠树突状细胞(DC)活化状态的影响,用Plasmodium berghei ANKA感染C57BL/6小鼠,3天后接种BCG(P.b-3-B实验组),同时以未接种BCG的感染小鼠为对照.通过动态观察两组感染鼠的原虫血症水平和生存率,流式细胞术检测感染后0、5和8天脾细胞中CD11c+CD11b+DC、CD11c+B220+DC、CD11c+CD80+DC和CD11c+MHCⅡ+ DC百分率.结果显示,P.b-3-B实验组的原虫血症从感染后第8天开始逐渐增高,66.7%的小鼠存活至第20天死亡,而对照组小鼠多于感染后8～10天死于脑型疟疾;感染后第5和8天,P.b-3-B实验组小鼠CD11c+CD11b+DC、CD11c+CD80+DC和CD11c+MHCⅡ+DC百分率均显著低于对照组(P<0.05或P<0.01),感染后第8天,CD11c+B220+DC百分率也明显低于对照组(P<0.01).这些结果表明,疟原虫感染早期接种BCG可下调DC亚群百分率和表面分子表达水平,并以此影响疟疾的感染进程.

青蒿提取物对伯氏疟原虫超微结构的影响

采用4天抑制试验法,观察青蒿提取物和青蒿素对伯氏疟原虫超微结构的影响.结果显示,青蒿提取物和青蒿素均使原虫滋养体膜结构损伤,表现为虫体表膜、食物泡膜、限制膜、线粒体膜、内质网、核膜呈现肿胀及膜间隙增宽.有些虫体表膜、食物泡膜呈现多层螺纹膜样改变.严重病变的原虫滋养体退变崩解,结构消失,残留退变的食物泡和吞噬泡散在红细胞内.此外,还观察到青蒿提取物和青蒿素对疟原虫纳虫泡内裂殖子发育有抑制作用.试验证明,青蒿提取物和青蒿素对伯氏疟原虫滋养体的超微结构损伤部位和病变特征基本相同;并提示对疟原虫纳虫泡内裂殖子发育有一定影响.

实验观察伯氏疟原虫再感染对免疫记忆形成的影响

目的 探讨疟疾再感染对免疫记忆形成的影响.方法 用伯氏疟原虫感染DBA/2小鼠,感染后3 d进行根治性治疗,并于初次感染后90 d进行再感染.通过姬姆萨薄血膜染色法计数红细胞感染率,流式细胞术检测再感染前(0 d)和再感染后(1、3、5 d)不同时间点脾细胞中记忆性T细胞和记忆性B细胞百分率.结果 再感染前小鼠脾细胞中记忆性T、B细胞百分率均略高于正常鼠;再感染后,小鼠仅出现短暂的低水平原虫血症,记忆性T、B细胞百分率分别于再感染后第1 d和第3 d较对照组显著升高(P＜0.01).但再感染后第5出现一定程度的下降.结论 疟疾再感染可促进免疫记忆的产生,但高水平的免疫记忆不能持久存在.

复方磷酸萘酚喹对疟原虫DNA含量及溶酶体pH值的影响

目的:探讨磷酸萘酚喹及其复方的抗疟作用机制.方法:采用流式细胞术(FCM)分析了磷酸萘酚喹、青蒿素及两者组成的复方对鼠伯氏疟原虫K173株DNA含量及溶酶体pH值的影响.结果:复方磷酸萘酚喹和青蒿素均可以使原虫寄生率迅速下降,但两者对原虫DNA含量的影响均不明显.磷酸萘酚喹单药给药后1h疟原虫溶酶体pH值开始升高,药后2h升至高,到4h基本恢复至药前水平;青蒿素对疟原虫溶酶体pH值的影响是先降后升;复方磷酸萘酚喹给药后溶酶体pH值变化类似青蒿素,但作用较弱.结论:复方磷酸萘酚喹和青蒿素的杀虫机制与其对疟原虫DNA及疟原虫溶酶体 pH值的影响不相关.

伯氏疟原虫感染不同年龄小鼠免疫反应特点

目的 了解伯氏疟原虫(Plasmodium berghei NK65,P.b NK65)感染幼年和中年C57BL/6小鼠免疫反应特点.方法 P.b NK65感染3周龄幼年和8月龄中年C57 BL/6小鼠,采用流式细胞分析技术检测不同年龄组小鼠脾细胞悬液中髓样树突状细胞(dendritic cells,DCs)数量,表面表达MHCⅡ类分子和CD86分子的DCs数量以及分泌IgG抗体的B细胞数量；ELISA方法检测脾细胞培养上清中IFN-γ和IL-4水平.结果 3周小鼠DCs数量[(40.08 ±3.54)×105]在感染后5d明显升高,8月龄鼠在感染后5 d[(103.47 ±11.07) ×105]及8 d[(104.04±1.92) ×105]明显升高；3周鼠表面表达MHCⅡ类分子和CD86分子的DCs数量在感染后明显升高,8月龄鼠在感染后8d表达MHCⅡ类分子[(239.40±16.32)×105]和CD86分子[(148.48±14.84)×1o5]数量明显高于3周鼠(P ＜0.05)；3周鼠[(251.01 ±34.02) pg/mL]和8月龄鼠[(584.17±54.03) pg/mL] IFN-γ水平在感染后5 d均明显升高,2组比较差异有统计学意义(P＜0.05).结论 3周和8月龄C57BL/6小鼠感染P.b NK65后,其细胞免疫和体液免疫存在明显差异.

感染伯氏疟原虫的小鼠树突状细胞体外扩增培养及形态观察

目的:体外诱导和扩增感染伯氏疟原虫小鼠骨髓来源的树突状细胞(DC),并探讨其与疟疾发病机制的关系.方法:感染伯氏疟原虫的BALB/c实验小鼠组与正常对照组小鼠各7只,将其股骨骨髓细胞分离.去除悬浮细胞,贴壁细胞中加入细胞因子(IL-4和GM-CSF)继续进行培养,2周后,诱导的DC经相差显徽镜进行观察.结果:DC在体外经细胞因子的刺激可增殖,但实验组小鼠DC增殖速度和数量明显低于对照组小鼠(P＜0.05).结论:感粢伯氏疟原虫的小鼠DC形态和数量的改变,可能由此导致其功能的改变,这可能是造成疟疾患者感粢持续发展的原因之一.

免疫电镜观察定位于斯氏按蚊胃的伯氏疟原虫环子孢子蛋白及血小板反应素相关粘附蛋白

蚊龄对斯氏按蚊感染伯氏疟原虫能力的影响

目的 研究不同日龄斯氏按蚊(Anopheles stephensi)传播伯氏疟原虫(Plasmodium berghei)能力的变化以及可能机制. 方法 选取4日龄和25日龄雌性斯氏按蚊,用原虫血疟为4％～8％的伯氏疟原虫感染BALB/c小鼠饲喂蚊虫,感染后8d解剖蚊虫肠道,镜检计数蚊虫肠道中疟原虫卵囊数,比较4日龄和25日龄蚊虫对疟原虫易感性的变化.选取感染前4日龄和25日龄雌性斯氏按蚊,采用LB平板培养法检测其体内可培养共生菌的量,用实时定量PCR (real-time quantitative PCR,qPCR)方法检测其体内的共生菌总量.选取感染前4日龄和25日龄雌性斯氏按蚊,采用qPCR检测其体内天蚕抗菌肽1(cecropin,CEC1)、CEC3、防御素(defensin,DEF;gambicin,GAM)、攻击素(attacin,ATT)以及一氧化氮合成酶(nitric oxide synthase,NOS)、双氧化酶(dual oxidase,DUOX)和含硫酯蛋白1(thioester protein 1,TEP1)等主要免疫效应因子的表达水平. 结果 感染伯氏疟原虫后8d,4日龄斯氏按蚊中肠道疟原虫卵囊中位数是139,25日龄按蚊卵囊数中位数是3.4日龄按蚊伯氏疟原虫的感染密度是25日龄的46倍(P＜0.01).qPCR结果显示,25日龄蚊虫体内共生菌总量为4日龄蚊虫的1.5倍,差异有统计学意义(P＜0.05);LB平板培养法结果显示,25日龄肠道可培养共生菌平均为28 889个菌落形成单位(colony forming units,cfu),是4日龄(3 200 cfu)的9倍,差异有统计学意义(P＜0.01).25日龄斯氏按蚊体内NOS基因表达量是4日龄的2.4倍(P＜0.01),抗菌肽ATT、DEF、CEC3、CEC1的表达量分别为4日龄的27％、48％、14％、61％,差异均有统计学意义(P＜0.05);4日龄与25日龄斯氏按蚊体内GAM、DUOX、TEP1的表达量均未发生显著变化. 结论 随斯氏按蚊日龄增加,斯氏按蚊抗菌肽水平发生显著下调,体内共生菌增多,NOS表达量上调,按蚊抵抗疟原虫的能力增强.

补体成分Ficolin-A抗小鼠感染伯氏疟原虫的研究

目的 探讨免疫系统补体成分Ficolin-A抗伯氏疟原虫(Plasmodium berghei)感染的效果. 方法 克隆扩增伯氏疟原虫裂殖子表面蛋白MSP119基因,构建pGEX-KG-MSP119质粒.将pGEX-KG-Ficolin-A质粒和pGEX-KG-MSP119质粒分别转染至大肠埃希菌(E.coli)BL21,1 mmol/L异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导表达,谷胱甘肽琼脂糖凝胶4B柱纯化重组蛋白,十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺电泳(SDS-PAGE)和蛋白质印迹(Westernblotting)鉴定蛋白表达情况.40只小鼠随机均分为5组,Ficolin-A蛋白组和MSP119蛋白组小鼠每次注射蛋白20 μg,MSPl19蛋白+Ficolin-A蛋白组小鼠每次注射2种蛋白各20 μg,PBS对照组和GST对照组小鼠每次各注射PBS 200 μl和GST 20 μg,各组小鼠每2周免疫1次,共免疫4次.末次免疫后2周,各组小鼠腹腔注射感染伯氏疟原虫的红细胞300ul,分别于注射感染后第2、4、6、8和10天每组各取3只小鼠,尾静脉采血涂片,吉氏染色后,显微镜下计数感染的红细胞,计算疟原虫密度.感染疟原虫后第20天统计各组小鼠的存活数量. 结果 测序结果表明,pGEX-KG-Ficolin-A和pGEX-KG-MSP119质粒构建成功.SDS-PAGE和Western blotting结果表明,Ficolin-A融合蛋白的相对分子质量(Mr)约为69 000,MSP119融合蛋白约Mr41 000,均与预测值相符.动物实验结果显示,感染后第2、4、6、8和10天,MSP119蛋白+Ficolin-A蛋白组小鼠的疟原虫密度均略低于其他4组,至感染后第10天,疟原虫密度为(22.2±1.7)％,略低于MSP119蛋白组[(33.4±2.7)％]、Ficolin-A蛋白组[(36.2±3.1)％]、GST对照组[(43.8±4.8)％]和PBS对照组[(45.3±3.6)％],但差异均无统计学意义(P＞0.05).感染后第20天,PBS对照组8只小鼠均死亡,Ficolin-A蛋白组存活小鼠数量(3只)与GST对照组(2只)比较,差异无统计学意义(P＞0.05);MSP1t9蛋白+Ficolin-A蛋白组存活小鼠数量(6只)显著高于GST对照组(P.＜0.05). 结论 补体成分Ficolin-A对降低小鼠疟原虫密度效果不明显,联合MSP119使用可提高小鼠感染疟原虫后的生存机会.

伯氏疟原虫ANKA株抗哌喹系小鼠模型免疫学分析

目的 观察伯氏疟原虫(Plasmodium berghei,Pb)ANKA抗哌喹(PQR)系小鼠模型的免疫学特征.方法 64只昆明小鼠随机分为3组,A组和C组各16只,B组32只(其中16只用于观察存活天数).A组和B组小鼠分别经腹腔感染伯氏疟原虫ANKA株哌喹敏感系(PbPQS)和抗性系(PbPQR)红内期原虫1×107个(200μl血),C组(健康对照组)注射等量生理盐水.每组于感染后4、8、12和16d各取4只小鼠,取尾血制薄血膜镜检,计算红细胞原虫感染率(简称原虫率).脱颈处死小鼠,无菌取脾制备脾淋巴细胞悬液,用CCK-8法测定各组小鼠脾淋巴细胞经刀豆球蛋白A(Con A)刺激后的增殖反应,用Griess法和ELISA分别测定脾淋巴细胞培养上清中NO含量和γ干扰素(IFN-γ)水平.另取10只昆明小鼠,每鼠腹腔接种PbPQR系原虫约1×107个,待原虫率上升后下降,典型的原虫转变为蓝染细胞时,腹腔感染PbPQS系原虫(1×106个)进行攻击感染,观察小鼠原虫率和小鼠存活情况.结果 A组小鼠平均存活(9.0±3.0)d,感染后6～12d原虫率均＞50％,出现严重贫血.感染后16d,B组小鼠全部存活,原虫率为(26.66±2.54)％.A、B两组小鼠的脾淋巴细胞经Con A刺激后增殖显著,感染后12d,分别为0.65±0.08和0.86±0.20 (P＜0.01).脾淋巴细胞培养上清中,NO含量随感染时间延长而上升,感染后12d,A、B和C组分别为(48.80±3.49)、(54.80±2.17)和(7.80±0.71)μmol/L,三者比较差异有统计学意义(P＜0.01).A组脾淋巴细胞培养上清中IFN-γ水平随感染时间延长而上升,感染后12d达到高,为(752.20±39.49) pg/ml,B组于感染后8d升至峰值[(855.80±33.65) pg/ml],感染后12 d降至(620.20±27.11) pg/ml;感染后8d和12d,A组和B组IFN-γ水平的差异有统计学意义(P＜0.01).用PbPQS系攻击感染PbPQR系小鼠模型后10d,原虫率为(2.44±2.07)％,随之逐渐消失,感染后40d未检出虫体,无小鼠死亡.结论 伯氏疟原虫ANKA株哌喹抗性系感染小鼠的脾淋巴细胞增殖水平、NO水平和IFN-γ含量均显著高于PbANKA株PQS系感染小鼠,可诱导小鼠产生一定保护性免疫反应.

伯氏疟原虫红内期融合抗原的构建、表达及其免疫原性研究

目的 合成伯氏疟原虫红内期融合抗原基因PbCP-2.9,在毕赤酵母真核系统中表达其产物,并进行免疫原性分析.方法选取与恶性疟原虫红内期融合抗原基因PfCP-2.9具有同源性的伯氏疟原虫AMA1(Ⅲ)和MSPI1-19序列,融合形成PbCP-2.9基因.基凶序列经密码子优化,在毕赤酵母中分泌表达.60只BABL/c小鼠均分为6组,其中蛋白免疫组3组,分别用PbCP-2.9蛋白与福氏佐剂、ISA206和IMS1312佐剂乳化后,皮下注射免疫小鼠,抗原免疫剂量20μg/只·次,注射体积200 μl,共免疫3次,每次间隔2周.佐剂对照组3组,以PBS代替免疫抗原同法免疫.免疫前及每次免疫后1周鼠尾取血,分离血清.用ELISA和IFAT方法检测血清中特异性抗体的滴度及其与天然抗原的反应结果.结果 PbCP-2.9基因在毕赤酵母中分泌表达出Mr约26400的PbCP-2.9蛋白,其与抗伯氏疟原虫红内期原虫的血清能进行特异性反应;ELISA检测PbCP-2.9蛋白免疫组结果表明,福氏佐剂组第2次免疫后特异性抗体滴度为(52.62±11.26),第3次免疫后为(94.50±52.84); ISA206组第2次免疫后为(7.59±5.61),第3次免疫后为(25.60±16.92);IMS1312组第2次免疫后为(9.41±8.86),第3次免疫后为(28.92±12.98).福氏佐剂组第2次免疫后特异性抗体滴度分别为ISA206组的6.9和IMS1312组的5.6倍(F=81.06,P＜0.01),第3次免疫后分别为ISA206组的3.7和IMS1312组的3.3倍(F=13.29,P＜0.01).IFAT检测结果显示,经PbCP-2.9免疫的鼠血清与Pb ANKA株虫体表面抗原有阳性反应. 结论 PbCP-2.9基因在毕赤酵母中高效表达,重组抗原免疫原性强,其免疫血清能识别伯氏疟原虫天然抗原.

伯氏疟原虫T细胞免疫调节蛋白类似基因的原核表达和抗体制备

目的 克隆伯氏疟原虫T细胞免疫调节蛋白(PbTIP)类似基因,原核表达PbTIP重组蛋白,并制备其抗血清.方法 在GenBank中检索PbTIP类似基因序列,设计特异性引物,从伯氏疟原虫ANKA株扩增获得该基因cDNA片段,克隆人原核表达载体pGEX4T-1并转化大肠埃希菌BL21(DE3).经异丙基-β-D硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和蛋白质印迹(Western blotting)鉴定重组蛋白.用重组蛋白GST-PbTIP包涵体免疫BALB/c小鼠,以间接荧光抗体试验(IFAT)和Western blotting鉴定产生的抗体.结果 获得了纯化的重组蛋白GST-PbTIP及其相应抗体,该抗体可以识别相对分子质量(Mr)约为60000的伯氏疟原虫感染红细胞内的PbTIP蛋白.结论 获得PbTIP重组蛋白及其相应抗体.

伯氏疟原虫氯喹抗性株感染ICR小鼠脾脏树突状细胞成熟和B细胞活化

目的 研究伯氏疟原虫氯喹抗性株(RC株)和氯喹敏感株(N株)感染鼠脾脏B细胞活化与树突状细胞(Dc)的关系.方法 分别用感染N株或RC株疟原虫的红细胞(iRBC)腹腔接种感染ICR小鼠(1×106个iRBC/只).当小鼠原虫血症N株达50%～80%、RC株达61.7%～68.4%时,断颈处死取脾脏.常规方法制作石蜡切片.HE染色或免疫组织化学染色,进行组织学观察.制作超薄切片,透射电镜观察脾脏细胞的变化.制作冰冻切片进行免疫荧光观察.流式细胞仪分析比较B细胞和DC变化.结果 RC株感染小鼠脾脏白髓增生明显,抗B细胞的特异性表面分子CD45R/BB220和CD19抗体同时表达阳性的B细胞在脾细胞中的百分比增加,中、小淋巴细胞数量增多,在红髓内浆母细胞与成熟的浆细胞数量增多.而N株感染小鼠脾小体则以大、小淋巴细胞为主,生发中心不明显,红髓可见大量的含疟原虫的红细胞、小淋巴细胞,而浆母细胞和其他发育期浆细胞则少见.RC株感染小鼠脾脏内白细胞分化抗原11c(CD11c)阳性的DC数量明显增多,尤其动脉周围淋巴鞘T细胞区.并且这些DC表面主要组织相容性复合体Ⅱ(MHCⅡ)类分子表达明显升高.表明主要是成熟的DC增多.DC外形不规则,胞质丰富,电子密度高,含发达的高尔基复合体和吞噬泡样结构. 结论 RC株感染小鼠脾脏成熟的DC明显增加,从而诱导B细胞的活化增殖.

伯氏疟原虫顶端膜抗原1胞外区及其亚区的表达与免疫保护作用分析

目的 表达伯氏疟原虫顶端膜抗原1(PbAMA-1)胞外区E及其各亚区,分析其免疫原性和免疫保护作用.方法 抽提伯氏疟原虫基因组,对PbAMA-1基因测序,依据该序列采用毕赤酵母密码子使用频率重新设计PbA-MA-1基因序列.将其胞外区E分为3个彼此重叠的基因片段D Ⅰ、DⅡ和DⅢ并进行优化,人工合成后在大肠埃希菌中诱导表达.表达产物经纯化和重折叠,分别与福氏佐剂乳化后免疫小鼠和家兔,均免疫3次,间隔2周.每次免疫剂量,小鼠为20μg,家兔为100μg.ELISA检测抗体效价,并以疟原虫攻击实验确定各抗原的免疫保护效果.结果 测得的PbAMA-1基因序列与Sanger测序中心公布的序列完全一致.密码子优化并人工合成的D Ⅰ、DⅡ、DⅢ和E目的基因片段在大肠埃希菌表达载体pET32a均获得诱导表达,经十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析,各目的基因表达产物大小与预计的相对分子质量Mr 44 300、Mr33 300、Mr 29 900和Mr 67 200相一致.表达产物经镍离子螯合柱(Ni-NTA柱)纯化和谷胱甘肽(GSH)氧化还原法体外重折叠,蛋白纯度达90%以上,各纯化的重组蛋白在小鼠体内均激发产生高滴度抗体.其中,完整的胞外区E第3次免疫后抗体滴度为(34.4±0.15)×10-4,与其他组相比,免疫原性较其他各亚区更强(t=5.66,P＜0.01;t=2.27,P＜0.05和t=5.05,P＜0.01).取家兔免疫血清与感染伯氏疟原虫ANKA株的小鼠血膜抗原片进行间接荧光抗体试验(IFAT),均为阳性,其中抗E的抗血清免疫荧光强度高,与ELISA检测的抗体水平一致.取家兔抗血清对小鼠伯氏疟原虫粗提抗原进行蛋白质印迹(Western blot)分析,产生特异性反应条带,表明能够识别天然的PbAMA-1蛋白.免疫小鼠在以伯氏疟原虫攻击实验中得到部分保护,D Ⅰ、DⅡ、DⅢ和E各免疫组小鼠与佐剂对照组相比,存活时间明显延长(t=2.78,P＜0.05;t=2.67,P＜0.05;t=3.46,P＜0.01和t=3.50,P＜0.01).结论 人工合成的PbAMA-1具有良好的免疫原性和免疫保护作用,完整的胞外区E较其各亚区表现出更好的免疫原性.