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丁酸钠诱导体外培养的大鼠肝卵圆细胞分化为成熟肝细胞
目的探讨分化刺激剂丁酸钠对体外培养的大鼠肝卵圆细胞分化的影响. 方法从喂养含0.1%乙硫氨酸的胆碱缺乏性饮食4～6周的大鼠肝脏中分离出肝卵圆细胞,用免疫细胞化学和逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)等方法对其进行鉴定.用0.75 mmol/L丁酸钠处理大鼠肝卵圆细胞后,姬姆萨染色观察细胞表型改变,weste rn blot检测细胞白蛋白的表达水平.结果免疫细胞化学结果显示分离出的细胞既表达成熟肝细胞的标志物白蛋白,也表达胆管细胞的标志物细胞角蛋白19,RT-PCR结果显示这些细胞还表达干细胞的标志物c-kit,但不表达造血干细胞的标志物CD34,表明这些细胞是大鼠肝前体细胞--肝卵圆细胞.0.75 mmol/L丁酸钠能诱导大鼠肝卵圆细胞出现明显的表型改变,细胞变大、变圆,核浆比减小,且双核细胞数增多,约占总细胞数的50%左右,同时western blot的结果显示0.75 mmol/L丁酸钠能够提高大鼠肝卵圆细胞白蛋白的表达水平. 结论分化刺激剂丁酸钠能诱导体外培养的大鼠肝卵圆细胞向成熟肝细胞分化.
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大鼠肝卵圆细胞的分离培养及脾内移植研究
目的观察肝卵圆细胞在同种异体大鼠脾内移植的演变结果,为肝干细胞移植治疗临床肝功能衰竭提供实验依据. 方法采用改进的梯度离心法分离肝卵圆细胞,体外培养鉴定后移植入2/3肝切除的同种异体大鼠脾脏内. 结果每只模型大鼠肝脏中可分离获得约1.69×105/ml肝卵圆细胞.体外培养的肝卵圆细胞呈现上皮细胞的生长特点,对OV6、细胞角蛋白19及甲胎蛋白染色呈阳性反应,对白细胞共同抗原染色呈阴性反应.肝卵圆细胞植入异体大鼠脾脏内可形成岛屿状肝组织结构,形成"肝化脾". 结论大鼠肝卵圆细胞具有肝干细胞的生物学特征,在一定条件下可分化为肝细胞及胆管上皮细胞.
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乙肝病毒X蛋白通过激活c-myc诱导肝卵圆细胞的恶性转化
目的 研究c-myc对乙型肝炎病毒X蛋白(Hepatitis B virus X,HBx)诱导肝卵圆细胞恶性转化的影响.方法 通过HEK293细胞扩增腺病毒获得高滴度的Ad-EGFP和Ad-HBx,分别感染肝卵圆细胞株WB-F344细胞,通过RT-PCR和Western blot验证HBx蛋白对c-myc表达的影响.应用特异性对应c-myc基因的siRNA转染各组细胞.运用体外成瘤法、流式细胞术、细胞迁移实验,观察c-myc特异性siRNA对HBx诱导卵圆细胞恶性转化的影响.结果 与空白对照组Ad-EGFP相比,实验组转染Ad-HBx后,细胞中的c-myc表达水平增高;WB-F344-HBx细胞Go/G1期细胞比例显著降低、S期细胞比例显著升高;第1天3组细胞都以单细胞形式悬浮生长,随着时间延长,WB-F344-HBx细胞逐渐形成致密的细胞球体并且数量逐渐增多、体积逐渐增大;WB-F344-HBx细胞的迁移能力显著高于对照组.WB-F344-Mock和WB-F344-EGFP组之间各项指标均无明显差异.c-myc基因沉默后,3组细胞间各项指标均无明显差异.结论 乙型肝炎病毒X蛋白通过激活c-myc基因从而诱导肝卵圆细胞恶性转化.
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大鼠成体肝卵圆细胞分离培养及诱导分化的初步研究
目的 通过成体大鼠肝卵圆细胞分离培养获取纯净的干细胞并观察诱导分化前后从肝卵圆细胞到肝细胞的形态变化.方法 采用AAF/PH肝干细胞刺激模型,胶原酶Ⅳ消化分离和Percoll梯度离心纯化肝卵圆细胞的方法,用地塞米松、DMSO和EGF、HGF、SCF、LIF等生长因子联合应用诱导肝卵圆细胞增殖和分化为肝实质细胞.观察肝卵圆细胞到肝细胞形态变化过程,用免疫荧光技术,Western blotting分析检测了干细胞标志c-kit和RT-PCR分析法检测肝干细胞白蛋白和CK19 mRNA表达鉴定卵圆细胞.结果 分离得到的肝卵圆细胞活度达到90%,细胞形态包括大小和颜色呈不均质,卵圆细胞直径是肝细胞直径的1/4～1/6.诱导后出现大而圆的肝细胞,可见卵圆细胞到肝细胞的中间变化过程,新分离的肝卵圆细胞在生长因子诱导下有向肝细胞分化的特性.经c-kit免疫荧光染色显黄绿色荧光,Western blotting检测肝卵圆细胞有c-kit蛋白条带,而大鼠肝细胞及胆管细胞则未出现条带.PCR分析显示卵圆细胞有CK19和白蛋白mRNA表达.结论 新分离的肝卵圆细胞同时表达c-kit,CK19和白蛋白3种抗原,诱导分化出现一系列从卵圆细胞到肝细胞的形态学变化,这种现象证明分离的肝卵圆细胞就是肝干细胞,经诱导分化可以产生成熟的肝细胞,成为进一步研究肝干细胞生物学特性的基础.
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2-乙酰氨基芴对大鼠肝卵圆细胞增殖模型的影响
目的在建立大鼠肝卵圆细胞增殖模型的基础上,进一步研究2-乙酰氨基芴(AAF)对大鼠肝卵圆细胞增殖的影响.方法按本室建立和改进的方案建立大鼠肝卵圆细胞增殖模型,AAF剂量分别按10、20及25 mg/kg给予,同时设单纯切肝对照组、假手术对照组及生理盐水对照组,重点观察大鼠肝组织结构变化及不同剂量下肝卵圆细胞增殖情况.结果3个对照组大鼠肝组织内均未见到肝卵圆细胞,而3个实验组均见肝卵圆细胞增生;与10 mg/kg剂量组比较,20 mg/kg及25 mg/kg两个剂量组大鼠肝组织内的肝卵圆细胞增殖更加明显,但25 mg/kg剂量组大鼠死亡率较高,存活大鼠健康状况差.结论AAF可诱导大鼠肝卵圆细胞增殖,剂量以20 mg/kg较为理想.
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携带IL-13基因大鼠肝干细胞系的建立
目的 构建包含IL-13基因片段的慢病毒载体,培养IL-13基因工程大鼠肝干细胞(肝卵圆细胞,HOC,WB-F344细胞),将IL-13基因重组至WB-F344细胞中,使之可分泌大鼠IL-13.方法 人工合成大鼠IL-13基因,利用pWPXL-MOD(TG-005)载体构建包含大鼠IL-13基因片段的质粒; 制备慢病毒穿梭质粒及其辅助包装元件载体质粒,四质粒载体(组成为pRsv-REV、pMDlg-pRRE、pMD2G及目的穿梭质粒)分别进行高纯度无内毒素抽提,共转染293T细胞,培养48 h后,收集富含慢病毒颗粒的细胞上清液,对其浓缩后得到高滴度的慢病毒浓缩液,定量PCR检测病毒滴度.将构建好的慢病毒感染WB-F344细胞,5 d后采用real-time PCR检测WB-F344细胞中IL-13的表达水平,Western blot检测重组蛋白表达水平.结果 成功构建了IL-13过表达慢病毒载体,并获得IL-13基因工程大鼠肝干细胞; 将IL-13基因重组至WB-F344细胞基因组中,并可在细胞中进行转录,慢病毒感染WB-F344细胞存在IL-13 mRNA表达,可分泌大鼠IL-13.结论 构建的基因工程WB-F344细胞能显著分泌大鼠IL-13,感染后的WB-F344细胞的IL-13表达水平显著高于感染前,满足动物实验要求.
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肝干细胞与肝癌关系的研究现状与临床价值
目的 探讨肝干细胞与肝癌的关系及其临床应用前景.方法 对国内、外相关研究成果进行回顾性分析. 结果肝癌可能是肝干细胞分化不全或分化异常造成并由各种不同分化等级的细胞组成的.结论 肝干细胞假说正逐渐得到广泛认同,对其的不断深入研究对揭示肝癌的细胞起源,研究肝癌的发生、转移机理等有重要意义.
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SDF-1/CXCR4在大鼠肝卵圆细胞增殖过程中的表达及意义
目的 研究基质细胞衍生因子-1(stromal cell-derived factor-1, SDF-1)及其受体CXCR4、CK18、CK19及AFP在大鼠肝卵圆细胞增殖过程中的表达情况,进一步探讨SDF-1/CXCR4生物学轴的作用.方法 选择144只体重180~200 g雄性Wistar大鼠,按随机抽签法平均分为4组后分别给予不同的处理,即灌喂2-乙酰氨基芴(2-acetylaminofluorene, AAF)和(或)尾猜鲎⑸銫XCR4的特异性抑制剂AMD3100,并联合行部分肝切除术(PH),因而分别命名为AAF组、AAF/AMD3100组、AMD3100组和PH组.AAF剂量为15 mg/(kg · d),AMD3100剂量为1.25 mg/(kg · d).各组分别于手术后第3、5、7、10、14和21 d各处死6只大鼠,取其肝组织行常规组织学观察,采用免疫组织化学染色法检测肝卵圆细胞中SDF-1及其受体CXCR4、CK18、CK19和AFP的表达. 结果 AAF组大鼠肝组织内见明显的肝卵圆细胞增殖反应且卵圆细胞胞浆CK18、CK19、AFP和SDF-1及其受体CXCR4染色均呈阳性; AAF/AMD3100组大鼠肝卵圆细胞增殖的数量和SDF-1及CXCR4阳性细胞数较AAF组明显减少(P＜0.05,P＜0.01); AMD3100组及PH组大鼠肝组织均未见到卵圆细胞. 结论肝卵圆细胞在增殖过程中表达CK18、CK19、AFP和SDF-1及其受体CXCR4,SDF-1/CXCR4轴可能有刺激肝卵圆细胞增殖的作用.
关键词： 肝卵圆细胞 基质细胞衍生因子-1 免疫组化 CXCR4 -
大鼠肝卵圆细胞的分离培养及干细胞标志分析
目的 研究简单易行的成体大鼠肝卵圆细胞的分离培养及干细胞鉴定方法.方法 采用2-乙酰氨基芴/部分肝切除术刺激建立成体大鼠肝卵圆细胞增殖模型,于肝切除术后第12 d切取剩余肝脏,使用胶原酶Ⅳ消化分离和Percoll梯度离心纯化肝卵圆细胞,免疫荧光技术和RT-PCR分析法检测肝卵圆细胞标志物mRNA表达.结果 分离得到的肝卵圆细胞存活率达到90%,经c-kit免疫荧光显色,PCR分析显示有CK19和白蛋白mRNA表达.生长因子诱导下有向胆管细胞和肝细胞分化的特性.结论 简单易行的肝卵圆细胞分离纯化及鉴定方法和肝卵圆细胞成功培养,为进一步研究肝干细胞生物学特性和与肝癌的关系提供了物质基础.
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肝卵圆细胞与原发性肝癌的相关性研究
目的:探讨肝卵圆细胞与原发性肝癌的相关性,为原发性肝癌发生的“癌干细胞”假说提供临床病理学依据.方法:运用免疫组化方法检测不同肝病组(检测对照组、肝血管瘤组、良性肝病合并肝硬化组、肝癌组、肝癌合并肝硬化组)肝脏组织中表达Ck-7、Ck-8/18、Ck-19、C-kit、AFP肝卵圆细胞数.结果:Ck-7、Ck-8/18、Ck-19阳性的肝卵圆细胞在上述各检测组中均有表达,AFP阳性的肝卵圆细胞仅在肝癌组中表达.各组间表达的Ck-7、Ck-8/18、Ck-19、C-kit、AFP阳性的肝卵圆细胞数目随病变由良性疾病向恶性疾病变化而增加.肝癌组、肝癌合并肝硬化组间表达的C-kit阳性的肝卵圆细胞数有显著性差异(P＜0.05).结论:肝卵圆细胞参与了原发性肝癌的生长、细胞分化调控.
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大鼠肝卵圆细胞细胞间黏附分子-1的表达及其调控
目的:探讨细胞间黏附分子-1(ICAM-1)在肝卵圆细胞(HOCs)中的表达,及核因子(NF-κB)对其表达的调控作用.方法:0.6g/kg 3'-甲基-4-二甲基胺偶氮苯(3'-methyl-dimethylaminoazo benzene,DAB)饲喂Wistar大鼠4wk,制作肝损伤模型.利用Percoll密度梯度离心法分离HOCs,免疫细胞化学检测HOCs对ICAM-1的表达;体外培养HOCs并分别用NF-κB激动剂TNF-α和NF-κB抑制剂TGF-β1干预,RT-PCR对ICAM-1 mRNA进行半定量分析,比较在TNF-α和TGF-β1的调控下ICAM-1 mRNA表达的变化.结果:HOCsICAM-1免疫细胞化学检测明显阳性.与对照组比较,体外培养HOCs时TNF-α促进HOCs的增殖(P＜0.01),TGF-β1对HOCs的增殖能力无明显影响;RT-PCR半定量分析,与对照组比较,TNF-α组ICAM-1 mRNA相对灰度值增高(P＜0.01),而TGF-β1组ICAM-1 mRNA相对灰度值降低(P＜0.01).结论:在肝损伤组织中HOCs表达ICAM-1,TNF-α和TGF-β1分别通过对NF-κB活性的促进和抑制来调控ICAM-1的表达.
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肝干细胞分析研究进展
近年来干细胞研究成为生物医学领域研究的热点.肝干细胞是一种具有双向分化能力和自我更新能力的细胞,参与肝脏生长、发育与再生.肝干细胞分化的过程和机理较为复杂,利用肝干细胞进行细胞移植与生物人工肝治疗各种终末期肝病被认为是有前途的方法之一.本文综述肝干细胞领域近年来研究进展.
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清肝化瘀方药对大鼠肝癌前病变中卵圆细胞表型的影响
背景与目的: 探讨清肝化瘀方药阻断二乙基亚硝胺(Diethylnitrosamine,DEN)Solt-Farber二步法致大鼠肝癌前病变的机制.材料与方法: 用DEN建立Solt-Farber二步法肝癌前病变短期动物模型,以不同浓度的清肝化瘀方药进行干预.透射电镜观察此模型中卯圆细胞的超微结构;酶组织化学方法检测γ-谷胺酰转肽酶(γ-GT酶)、葡萄糖-6磷酸酶(G-6-P酶)的表达变化;免疫组织化学方法检测甲胎球蛋白(AFP)、白蛋白(ALB)表达的变化.结果: 清肝化瘀方药能明显抑制肝癌前病变中肝细胞γ-GT酶的表达,增加G-6-P酶的表达;同时降低卵圆细胞及肝细胞中AFP的表达,增加ALB的表达.结论: 清肝化瘀方药可有效阻断肝癌前病变,大剂量组较小剂量组作用明显,其作用机制可能与诱导卵圆细胞向肝细胞主向分化有关.
