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细胞穿透肽PEP-1介导增强型绿色荧光蛋白在小鼠体内跨膜转导
目的 研究细胞穿透肽PEP-1介导的大分子物质在小鼠体内的跨膜转导能力.方法 用基因工程的方法制备并纯化增强型绿色荧光蛋白EGFP和PEP-1-EGFP融合蛋白,分别将500 μg的EGFP蛋白和PEP-1-EGFP融合蛋白通过尾静脉注射入昆明小鼠体内,2 h后麻醉小鼠,PBS充分灌流并取心、脑、肝、脾、肾快速冷冻切片后立即置荧光显微镜下观察.结果 2 h后PEP-1-EGFP融合蛋白处理的小鼠大脑、心肌、肝、脾和肾组织里出现均一的明亮绿色荧光,而EGFP蛋白处理的小鼠各脏器内均未见到绿色荧光.结论 细胞穿透肽PEP-1能携带增强型绿色荧光蛋白穿透小鼠细胞膜并分布于心、脑、肝、脾、肾组织内,为将来用PEP-1介导各种大分子药物跨膜转导进行各种疾病的蛋白治疗提供实验依据.
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人TAT-Survivin融合蛋白原核表达载体的构建
目的:构建人TAT-Survivin融合蛋白原核表达载体.方法:以人胸腺细胞瘤cDNA为模板,采用RT-PCR扩增survivin基因成熟蛋白编码的全部序列,克隆入原核表达载体pET28a(+)中,经限制性内切酶双酶切及DNA序列分析鉴定目的基因.结果:PCR扩增的特异性片段长度为462bp,以此构建的重组质粒pET28a-TAT-survivin,经HindIII和BamHI双酶切后显示5.9kb和462bp左右的两条片段,测序结果与Genbank中的人survivin基因cDNA(Genbank序列号)序列一致.证明人survivin已成功克隆到了原核细胞表达载体pET28a(+)中.结论:成功构建了pET28a-TAT-survivin重组原核表达载体.
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PTD-OD-HA融合蛋白对K562细胞中Bcr-Ab1的抑制作用观察
目的 探讨PTD-OD-HA融合蛋白转导K562细胞的动力学、定位及其与Bcr-Ab1定位的关系,以及对Bcr-Ab1寡聚化和Bcr-Ab1酪氨酸激酶活性的影响.方法 采用FITC标记PTD-OD-HA融合蛋白,观察蛋白转导K562细胞的效率与剂量和时间的关系,激光共聚焦显微镜检测融合蛋白在细胞内的定位,免疫共沉淀法检测融合蛋白与Bcr-Ab1的相互作用,Western blotting检测Bcr-Ab1的磷酸化水平.结果 PTD-OD-HA转导K562细胞呈剂量和时间依赖性.PTD-OD-HA定位于K562细胞胞质,与Bcr-Ab1共定位,且能与Bcr-Ab1蛋白相互作用,进而干扰Bcr-Ab1同源寡聚化,并可降低Bcr-Ab1的磷酸化水平.结论 在K562细胞中,PTD-OD-HA融合蛋白能有效抑制Bcr-Ab1同源寡聚化及磷酸化水平.
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对氧磷酶1融合蛋白的表达及其生物活性
目的：利用家蚕表达系统表达含蛋白转导肽P11的人血清对氧磷酶1（paraoxonase 1，PON1）融合蛋白，并对其抗敌敌畏（dichlorvos，DDVP）毒性的生物活性进行初步研究。方法 P11-PON1融合基因构建于家蚕表达载体pFastBac 5B多克隆位点，转化家蚕DH10BmBac 感受态细胞，收集病毒粒子并感染家蚕5龄幼虫，感染96 h 后，收获蛋白；SDS-PAGE 电泳分析P11-PON1融合蛋白占家蚕总蛋白比例，计算蛋白含量；利用小鼠和斑马鱼鉴定P11-PON1融合蛋白抗DDVP毒性的生物活性；每只小鼠灌胃或直肠给P11-PON1融合蛋白1mg，给药后立刻和3 h后，腹腔注射DDVP溶液20 mg/kg，观察小鼠中毒状态，计算存活率；P11-PON1融合蛋白溶于斑马鱼养殖水中，浓度分别为1、2.5、5、10和20 mg/L，给药后立刻和3 h 后加入终浓度为50 mg/L的DDVP溶液染毒，观察斑马鱼的行为变化，计算存活率。结果成功表达了P11-PON1融合蛋白，该蛋白占家蚕5龄虫总蛋白的8%；灌胃给予P11-PON1融合蛋白没有提高染毒小鼠的存活率；直肠给药后立刻染毒也没有显著提高小鼠存活率，而直肠给药3 h后再腹腔注射DDVP染毒，小鼠存活率显著提高（P<0.01）；斑马鱼给予P11-PON1融合蛋白后立即染毒DDVP，斑马鱼存活率并没有显著性提高，而给予P11-PON1融合蛋白3 h后再染毒DDVP，斑马鱼存活率显著提高，其中融合蛋白20和10 mg/L组24 h存活率均为62.5%，5 mg/L组存活率为50%，与对照组相比，差异显著提高（P <0.01）；2.5 mg/L组存活率为41.7%，与对照组相比差异有显著提高（P <0.05）。结论家蚕能够表达P11-PON1融合蛋白，该融合蛋白提前给药能降低DDVP对小鼠和斑马鱼的毒性作用。
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GST-TAT-P53c融合蛋白的表达及对p53基因突变型肿瘤细胞的促凋亡作用
目的 研究P53蛋白C端(P53c)对p53基因突变型肿瘤细胞SW480的促凋亡作用.方法 用人类免疫缺陷病毒TAT蛋白的蛋白转导域(TAT)将P53c运载进入肿瘤细胞,用氧依赖性降解区域(ODD)控制P53c在组织中的稳定性.通过PCR方法制备TAT-ODD-p53c(TOPc), TAT-p53c(TPc)及p53c基因,与pGEX4T载体连接后在大肠杆菌中表达谷胱甘肽-S-转移酶(GST)-TAT-ODD-P53c(GST-TOPc), GST-TAT-P53c(GST-TPc)及GST-P53c等融合蛋白.免疫组化方法检测TAT蛋白运载融合蛋白穿过SW480细胞膜的作用,MTT法检测融合蛋白对SW480细胞活力的影响,流式细胞仪检测致SW480细胞凋亡作用.结果 成功构建pGEX系列表达载体,并在大肠杆菌中可溶性表达.Western 印迹结果表明,重组蛋白可以和GST单克隆抗体特异性结合.免疫组化显示GST-TPc, GST-TOPcm及GST-TOPc均能进入SW480细胞,GST-TPc能明显降低SW480细胞活性,导致SW480细胞凋亡.含ODD的融合蛋白在常氧环境中对肿瘤细胞有轻度促凋亡作用.结论 TAT可以介导其融合蛋白跨越细胞膜.GST-TPc可引起p53突变型肿瘤细胞凋亡.
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特洛伊肽运载核酸的研究进展
特洛伊肽(trojan peptides),又称细胞穿透肽(cell-penetrating peptides,CPP)或蛋白转导域(protein transduction domains,PTD),是一类少于30个氨基酸的小肽片段,它们一般含有多个碱性氨基酸,能够高效跨越细胞膜并将多种不同类型的大分子物质(如多肽,蛋白质,核酸等)运送至细胞内.本综述主要阐述了利用特洛伊肽将质粒DNA和siRNA运送至培养的哺乳动物细胞以及动物体内的研究进展,并阐明了这一运载系统在基因功能研究和临床应用上的巨大潜力和意义.
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蛋白转导在基因治疗中的应用
蛋白转导是近几年生命科学领域发现的一种独特现象,具有蛋白转导功能的蛋白通过几个短的碱性小肽组成的蛋白转导域(proteintransduction domain,PTD)的介导,能将与其共价连接的DNA、多肽或蛋白质以及其他大分子物质通过非经典途径穿过细胞膜甚至血脑屏障,并在细胞间自由传递.PTD这种能携带融合蛋白自由进入细胞的独特功能为人类一些疾病的基因治疗提供了一种新的运载工具,在基因治疗中有着美妙的应用前景.
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多聚精氨酸蛋白转导域-凋亡素融合蛋白的原核表达及其生物活性
目的 原核表达多聚精氨酸蛋白转导域-凋亡素融合蛋白,并检测其生物活性.方法 应用PCR法扩增Arg9-VP3序列,与载体pET-43.1a连接后.转化E. Coli BL21(DE3),IPTG诱导表达.表达产物经Ni2+-NTA纯化后,进行肠激酶裂解、超滤浓缩,并检测其生物活性.结果 重组表达质粒pET-43.1a-Arg9-VP3经酶切鉴定和序列分析,证明构建正确.转化E. Coli BL21(DE3)后,重组蛋白获得可溶性表达.纯化的融合蛋白纯度达90%以上,可抑制HeLa细胞增殖.结论 已成功地在大肠杆菌中表达了多聚精氨酸蛋白转导域-凋亡素融合蛋白,纯化的融合蛋白具有诱导HeLa细胞凋亡的能力.
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HIV-Tat蛋白转导域的研究进展
HIV-Tat蛋白转导域具有穿膜活性,能够将与之共价连接的多肽、蛋白、核酸等生物大分子快速而高效地转导入细胞内部,且对细胞无毒副作用,在药物转运及疾病治疗等领域有着广阔的应用前景.本文对HIV-Tat蛋白的结构、穿膜机制及转导域功能的应用作一综述.
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PTD-CHMP1A融合蛋白抑制肾细胞癌细胞的恶性生物学行为
目的:探讨蛋白转导域(protein transduction domain,PTD)-染色质修饰蛋白1A (chromatin modifying protein 1A,CHMP1A)融合蛋白对肾细胞癌(renal cell carcenoma,RCC)细胞增殖、迁移、侵袭及体内移植瘤生长的影响.方法:分别用1、5、20 μg/ml的PTD-CHMP 1A (PTD-CHMP 1A组)、5 μg/ml的野生型CHMP1A(CHMP1A组)和PBS(PBS组)处理RCC细胞株A498和786-0.用MTT法检测PTD-CHMP1A对A498细胞增殖能力的影响,划痕愈合实验检测PTD-CHMP 1A对A498细胞迁移能力的影响,用Transwell侵袭实验检测PTD-CHMP1A对A498和786-0细胞的侵袭能力的影响.将5×105个/ml的A498细胞注射于裸鼠体内,构建RCC移植瘤模型,观察20 μg的PTD-CHMP 1A对移植瘤生长的影响.结果:与CHMP 1A和PBS组比较,1、5和20μg/ml的PTD-CHMP 1A对A498细胞的增殖均出现不同程度的抑制作用,且呈明显的剂量和时间相关性;5μg/ml的PTD-CHMP 1A可有效抑制A498细胞的迁移(P＜0.01)、A498和786-0细胞的侵袭能力(均P＜0.05),且抑制A498细胞的侵袭能力呈剂量相关性.PTD-CHMP1A在体内可有效抑制裸鼠体内移植瘤的生长.结论:PTD-CHMP 1A融合蛋白可以有效抑制RCC细胞的增殖、迁移、侵袭能力和体内移植瘤的生长.
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细胞穿透肽PEP-1在蛋白转导中的应用
文章对细胞穿透肽PEP-1在大分子物质体内外跨膜转导中的应用进行了综述,为进一步研究PEP-1介导有潜在治疗价值的大分子物质跨膜转导进行疾病的蛋白治疗提供了依据.
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带有HIV Tat-蛋白转导域的人成熟神经生长因子的分泌表达及鉴定
HIV-Tat蛋白转导域(protein transduction domain,PTD)是一个公认的具有介导靶蛋白跨膜作用的肽段.为了表达出可溶的并具有生物学活性的PTD-NGF融合蛋白,作者首先根据人神经生长因子成熟肽(hNGFm)的基因序列设计引物,利用PCR技术直接从人胎盘的基因组DNA中扩增出hNGFm的编码序列,同时利用PCR引物在其5'和3'末端分别加上HlV-Tat-PTD及组氨酸标签(His-Tag)的序列,然后将PCR产物克隆于原核表达质粒pET22b中pelB leader的下游,构建分泌表达质粒pET22b-PTD-hNGFm-His.将该质粒转入宿主大肠杆菌BL21(DE3)中,用IPTG进行诱导表达,SDS-PAGE检测显示有两种表达产物,Mr分别为16 ku和18.4 ku,分别位于大肠杆菌周质腔和细胞质中,两者均可与抗hNGF抗体反应.周质腔表达产物(PTD-hNGFm-His)经Ni2+螯合亲和层析纯化后纯度达98%以上,纯化的PTD-hNGFm-His融合蛋白刺激神经突起生长的适浓度为20 ng/ml.因此成功构建了PTD-hNGFm-His分泌表达载体并在大肠杆菌中进行了分泌表达,得到了可溶且具有生物活性的PTD-hNG-Fm-His融合蛋白.
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大肠埃希菌表达的含PTD穿膜序列的融合蛋白3种复性方法比较
目的: 探索融合蛋白PTD-NFATminiDBD-eGFP纯化以及复性的条件,以提高其复性效率,为后续融合蛋白生物学功能的研究做准备.方法: 表达、提取并纯化包涵体形式的融合蛋白PTD-NFATminiDBD-eGFP,分别用稀释复性、透析复性、柱上复性的方法,对融合蛋白进行复性,分析不同方法的特点及包涵体复性率,采用流式细胞术检测融合蛋白的穿膜活性.结果: 3种复性方法得到的融合蛋白复性率依次为:柱上复性得率高,其次是透析复性,稀释复性得率低.柱上复性后蛋白的穿膜效率高,相对较低的是稀释复性,而未复性的融合蛋白穿膜效率极低.结论: 3种复性方法均能对PTD穿膜蛋白复性,但以柱上复性佳.
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体内蛋白转导的研究进展
简要综述了几种能够携带药物跨越血脑屏障和细胞生物膜屏障的蛋白结构域的研究进展.
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转导血红素氧合酶-1蛋白减轻脑缺血/再灌注沙土鼠海马神经元的损伤
目的：评价血红素氧合酶-1(HO-1)蛋白转导对脑缺血/再灌注损伤沙土鼠海马神经元的影响。方法构建11R (11个精氨酸残基)-HO-1蛋白,50只沙土鼠随机分为5组(n=10)：脑缺血/再灌注组(C组),沙土鼠行脑缺血/再灌注损伤。脑缺血/再灌注+生理盐水组(S组)、脑缺血/再灌注+11R组(R组)、脑缺血/再灌注+5 mg·kg-111R-HO-1组(H1组)和脑缺血/再灌注+25 mg·kg-111R-HO-1组(H2组),各组沙土鼠腹腔分别注射5 mg·kg-1生理盐水、5 mg·kg-111R蛋白、5 mg·kg-111R-HO-1蛋白或25 mg· kg-111R-HO-1蛋白,3 h后行脑缺血/再灌注损伤。24 h后取沙土鼠海马,电镜下观察海马组织线粒体的变化,检测海马神经元凋亡、Caspase-3和HO-1蛋白表达、cAMP水平。结果 C组、S组和R组3组间海马神经元线粒体变性率、神经元凋亡率、Caspase-3和HO-1蛋白表达、cAMP水平变化无差异(P>0．05)；H1组海马神经元线粒体变性率降低、神经元凋亡率降低、Caspase-3蛋白表达下调、HO-1蛋白表达上调、cAMP水平升高(vs C组、S组和R组,P<0．01)；H2组海马神经元线粒体变性率降低、神经元凋亡率降低、Caspase-3蛋白表达下调、HO-1蛋白表达上调、cAMP水平升高( vs H1组,P<0．01)。结论 HO-1蛋白转导减轻了脑缺血/再灌注沙土鼠海马神经元的损伤。
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TAT-tCNTF融合蛋白对Aβ_(25-35)诱导SH-SY5Y细胞损伤的保护作用
目的 确定TAT-tCNTF融合蛋白能够透过细胞膜进入细胞内,并研究其对Aβ诱导SH-SY5Y细胞损伤的保护作用.方法 重组PCR获得人截短型CNTF基因后,与pBV 220-TAT载体连接,在大肠杆菌中表达,细胞免疫荧光方法检测TAT蛋白运载融合蛋白穿过SH-SY5Y细胞膜的作用,Aβ_(25-35)诱导SH-SY5Y细胞产生神经毒性,采用MTT(四甲基偶氮唑盐)法检测融合蛋白对细胞存活率的影响,Heochst 33342/PI荧光双染法进行细胞凋亡和坏死的形态学观察,并进行LDH释放分析进一步检测TAT-tCNTF对细胞损伤后的保护作用.结果 成功构建pBV220-TAT-tCNTF表达载体,Western blot结果表明重组融合蛋白可以与CNTF抗体特异性结合,细胞免疫荧光方法显示TAT-tCNTF能大量进入细胞,而rhCNTF只有微量进入细胞.对Aβ_(25-35)诱导损伤的SH-SY5Y细胞MTT、Heochst 33342/PI荧光双染法及LDH分析都表明TAT-tCNTF能明显提高细胞的存活率.结论 TAT-tCNTF融合蛋白可以跨越细胞膜,能够保护Aβ_(25-35)诱导损伤的SH-SY5Y细胞,具有促进细胞生存生长的活性.
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EGFP-Arg7融合蛋白表达及在HeLa细胞中的转导活性
目的 构建pET-28a-EGFP-Arg7重组子,观察表达的融合蛋EGFP-Arg7在细胞内的转导活性.方法 构建EGFP-Arg7(阴性对照为EGFP)序列,与pET-28a连接后,转化Ecoli BL21(DE3),IPTG诱导表达,并经Ni2+.NTA纯化.纯化产物作用于HeLa细胞后用荧光显微镜观察其转导活性.结果 重组pET-28a-EGFP-Arg7经酶切鉴定和序列分析,证明构建正确.转化E.coil BL21(DE3)后,重组蛋白获得可溶性表达.纯化后的融合蛋白纯度达90%以上.重组蛋白EGFP-Arg7作用于HeLa细胞后用荧光显微镜可观察到强绿色荧光.结论 Arg7具有很好的转导活性,能携带与其连接的蛋白质穿过HeLa细胞膜.
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人TAT-PDX-1融合蛋白在大肠杆菌中的表达与纯化
目的 构建人TAT-PDX-1表达载体,并对其融合蛋白进行纯化.方法 采用RT-PCR技术从人胰腺组织中获得目的基因hPDX-1,将TAT序列与PDX-1克隆到原核表达载体pET-28a;用IPTC诱导、表达融合蛋白;Ni-NTAagaros纯化融合蛋白,Western blot鉴定.结果 目的片段PDX-1被有效扩增,DNA序列测定表明所构建重组质粒pET28a-TAT-h PDX -1与设计相同;TAT-PDX-1融合蛋白在大肠杆菌中获得高效表达并成功纯化.结论 成功地获得了TAT-hPDX-1融合基因的表达产物,为进一步研究及临床应用奠定了基础.
关键词： 原核表达 蛋白转导域 胰十二指肠同源盒基因-1 -
TAT-p38(AF)融合肽的构建及其对紫外线诱导的p38 MAPK通路激活的抑制作用
目的 构建TAT蛋白转导域介导的p38(AF)MAPK蛋白转导系统,研究该蛋白转导系统对紫外线刺激引起的p38通路激活作用的影响.方法 将p38无活性突变体p38(AF)亚克隆至含有TAT蛋白转导域的pET-14b-TAT质粒,原核表达、纯化His-TAT-p38(AF)融合蛋白.激酶实验检测His-TAT-p38(AF)自身磷酸化作用.将该蛋白与NHI/3T3细胞孵育,Western blot法检测该蛋白的蛋白转导功能;紫外线照射后,检测内源性p38及其底物ATF2的磷酸化水平.结果 酶切、测序表明质粒构建正确;目的 蛋白被正确表达;His-TAT-p38(AF)融合蛋白无自身磷酸化作用;His-TAT-p38(AF)蛋白以浓度依赖性方式高效转导入细胞;His-TAT-p38(AF)的导入抑制紫外线诱导的内源性p38及其底物ATF2的磷酸化.结论 TAT蛋白转运系统能高效转导外源蛋白进入真核细胞;p38无活性突变体TAT-p38(AF)抑制紫外线诱导的p38 MAPK通路的激活.
关键词： p38丝裂原活化蛋白激酶 紫外线 蛋白转导域 -
人TAT-PDX-1融合蛋白原核表达载体的构建
目的 构建人TAT-PDX-1融合蛋白原核表达载体.方法 以人胰腺癌(PANC)-1细胞株cDNA为模板,采用反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)扩增胰腺十二指肠同源异型盒基因-1(PDX-1)蛋白编码的全部序列,克隆入原核表达载体pET28a中,经限制性内切酶HindⅢ和BamHI双酶切及DNA序列分析重组质粒的目的基因.结果 RTPCR扩增产物的特异性片段长度为885 bp,以此构建的重组质粒pET28a-TAT-PDX-1经HindⅢ和BamHI双酶切后显示5 900 bp和885 bp左右的2条片段,测序结果与Genbank中的人PDX-1基因cDNA序列一致.结论 成功构建了人TAT-PDX-1融合蛋白原核表达载体.
