首页 > 文献资料
-
恙虫病东方体黑龙江分离株的PCR分型
目的鉴定恙虫病东方体黑龙江分离株的基因型.方法采用PCR技术对分离自黑龙江省密山地区的6株恙虫病东方体sta56 kD目的基因进行分析研究,并与国际参考株进行比较.结果 MSAa9301株、MSAa9303株、MSAa9304株及MSAp9305株属于Gilliam型;MSAa9306株属于Karp型;MSAp9302株属于Kato型.结论黑龙江密山地区恙虫病东方体存在Gilliam、Karp和Kato 3种型别.
-
应用快速免疫层析法检测恙虫病特异性IgM、IgG及总抗体
目的建立快速免疫层析法检测恙虫病特异性IgM、IgG及总抗体,并对其敏感性和特异性进行评价.方法以胶体金标记纯化的基因工程重组抗原,在玻璃纤维上预包被金标记的纯化抗原(Au-Ag)和鼠IgG,在硝酸纤维素膜上检测线处包被羊抗人μ链、羊抗人IgG或重组抗原;在对照线处包被羊抗鼠IgG,组装成检测试纸.在试纸条的玻璃纤维上加待检血清,再滴加2滴反应液.观察金标抗原释放后NC膜上检测线和对照线的反应情况,检测线和对照线同时出现红色条带判为阳性,仅对照线出现红色条带判为阴性,对照线未出现条带为无效试验.结果间接免疫荧光法IFA检测IgG和金标免疫层析法检测IgM、IgG、总抗体的敏感性分别为88.1%,92.3%,90.9%和98.6%;特异性分别为96.0%,94.7%,94.7%和93.3%.结论金标免疫层析法可替代传统方法用于检测恙虫病东方体特异性抗体.
-
恙虫病东方体在无生命培养基内生长的研究
目的恙虫病东方体(Orientia tsutsugamushi;Ot)被认为属专性细胞内寄生.特别是制备大量抗原培养难的问题,是近一个世纪以来人们渴望解决的难题.为证实是否能在无生命培养基生长.方法用Vero-E6个单层组织细胞培养Ot JL-90株与标准Gilliam株,在合适时取该培养物接种于Ⅲ号无生命固体培养基培养,置36℃(±1℃)培养18-24h.结果可见生长一群无色透明或半透明光滑、湿润、圆形或枫叶样小菌落,并产生一种难闻的臭味.两种方法培养物分别做了生物学性状鉴定、形态染色、小白鼠致病力、血清学特异性间接免疫荧光检测.各株Ot经两种培养获得培养物特性基本一致.结论 Ot能在细胞内生长也能在无生命培养基内生长,解决了Ot大量抗原培养难的困扰.
关键词： 恙虫病东方体 Vero-E6细胞培养 无生命培养基培养 -
恙虫病东方体Gilliam株56kDa蛋白部分基因的原核表达及初步鉴定
目的对恙虫病东方体Gilliam株56kDa蛋白部分基因进行原核表达,以获得高效表达、有生物活性目的蛋白,为恙虫病诊断试剂的研制打下基础.方法根据Gilliam株东方体56kDa蛋白基因序列设计特定引物,用PCR法扩增出编码56kDa抗原富含亲水区及同源性高的C端一段长约700bp的DNA,插入原核载体PGEX-4T-2,转化大肠杆菌TGI,抽提质粒,酶切鉴定,含插入片段的重组质粒进行序列分析,再转化表达宿主菌大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达,用SDS-PAGE及Western-blot进行分析鉴定.结果SDS-PAGE检测表明该截短片段以融合蛋白的方式得到成功表达,在相对分子量58kDa处有表达条带,经薄层扫描分析,目的蛋白条带占全菌蛋白的30.5%.Western-blot证实该融合蛋白能被恙虫病患者阳性血清识别.结论表达产物初步鉴定具有生物活性,有望应用于恙虫病诊断试剂的研制.
-
西沙群岛恙螨所携恙虫病东方体的序列分析
目的用分子生物学技术鉴定西沙群岛恙虫病东方体的基因序列,探讨南海岛屿恙虫病疫源地的形成.方法以巢式聚合酶链反应(NPCR)检测西沙群岛恙螨所携恙虫病东方体的56kDa蛋白基因片段,继而将NPCR产物克隆进pGEM-T载体并且测序,测序结果在国际互联网作多序列比较和进化树分析.结果从西沙群岛收集的恙螨扩增出507bp目的片段,序列分析证实与Karp株同源性85%,与Gilliam株同源性68%,与Yonchon株同源性67%,与Kato株同源性65%.结论西沙群岛的恙螨携带恙虫病东方体以Karp型为主.
-
应用PCR／RFLP对辽宁、吉林地区恙虫病东方体分离株的基因型分析
目的鉴定辽宁、吉林地区恙虫病东方体分离株的基因型。方法采用PCR／RFLP技术对辽宁、吉林地区恙虫病东方体分离株的sta56目的基因进行分析研究，并与国际参考株进行比较。结果辽宁、吉林地区6株分离株的PGR特异性产物经Hinf I、Hha I、Rsa I酶切后呈现2种不同的RFLP图谱：HCAa9202株、HCAp9203株及HCM9501株与Gilliam参考株具有相似的酶切图谱，但缺乏Hinf I的酶切位点；KDCt9402株、KDCp9403株及KDCt9404株与Karp参考株具有相同的酶切图谱。结论 KDCt9402株、KDCp9403株及KDCt9404株属于Karp型；HCAa9202株、HCAp9203株及HCM9501株属于Gilliam型，但基因序列可能存在遗传差异。
-
套式PCR应用于恙虫病鼠类标本的检测研究
目的评价基因扩增法应用于检测鼠类标本调查恙虫病疫源地的作用。方法用一定量恙虫病东方体人工感染昆明种小鼠，攻击后第3、6、9天处死小鼠取血块及脾脏用特异性套式PCR技术进行恙虫病东方体DNA的检测，再用该技术测定现场采集的鼠类标本，以可从标本中扩增出一段长88bp的DNA片段作为实验或现场捕获鼠感染了恙虫病东方体的指标，继而估计该地区是否存在恙虫病疫源地。结果实验感染恙虫病东方体3天时在两类标本中均不能检出该病原DNA，而第6天测定时均可发现含有恙虫病东方体；从福建闽西北地区采集的111份鼠类脾脏中检出1份阳性标本，另从江西送检的29份野鼠血块中也检出1份阳性标本，说明采集标本区域已成为恙虫病疫源地。结论套式PCR扩增技术具有很好的特异性和敏感性，可用于现场鼠类标本的恙虫病病原学的调查。
-
云南省永善县恙虫病流行病学调查
目的 对云南省永善县恙虫病开展流行病学调查.方法 应用胶体金免疫试验对发热患者血清进行恙虫病东方体(Orientia tsutsugamsushi)IgG和 IgM抗体检测,采用夜夹法诱捕调查地区鼠类,用巢氏 PCR方法对鼠脾脏做groEL 基因片段扩增和基因序列分析.结果 2015年5-10月在永善县发现恙虫病患者34例,其中实验室确诊病例21例,临床诊断病例13例;主要发病于8月,占总病例数的32.35%;40—49岁年龄组发病多,占总病例数的32.35%;农民发病数多,占总病例数的79.41%;有焦痂或溃疡的病例占总病例数的94.12%,其中位于腹股沟多(占有焦痂或溃疡患者的31.25%);有皮疹的病例占总病例数的50.00%.在捕获的39 份黄胸鼠(Rattus flavipectus)脾组织样品中,恙虫病东方体groEL基因片段扩增阳性 9 份(阳性率 23.08%).groEL基因片段序列进化树分析显示本次检测到的 YSP30 株与的 HSB1、FAR1、UAP4 等Saitama型菌株的遗传进化关系密切,检测到的其余8株与 UT213、UT221、SH205等 Karp 型菌株的遗传进化关系密切.结论 血清学和分子生物学方法证实了永善县存在恙虫病疫源地,当地存在 Karp 和 Saitama相关的2种基因型恙虫病东方体.
-
汉坦病毒和恙虫病东方体复合感染的实验研究
目的了解汉坦病毒(HV)和恙虫病东方体(Ot)在宿主体内能否共生及其共生特征.方法采用HV和Ot先后交替、重复感染实验鼠,20 d后取鼠脏器切片和刮片用IFAT和Giemsa染色观察其感染率和脏器分布;并用Vero-E6细胞体外培养法研究HV、Ot在宿主细胞内的共生特征.用RT-PCR和PCR进行基因鉴定.结果HV和Ot先后交替、重复感染的各组实验鼠中,均可发现两种病原体的复合感染,其中HV和Ot单纯感染组的阳性率均显著高于HV、Ot先后和同时感染组.5组感染Vero-E6细胞培养检测结果发现:先后、同时和单纯实验感染的5组细胞中,HV和Ot先后、同时接种感染组在细胞传至第3代时检测均见有HV和Ot的双重感染,阳性率随传代次数增加而增加.而HV和Ot单纯分别感染组细胞传第2代时即可检测到HV和Ot,阳性率亦随传代次数的增加而增加.在传代培养中单纯感染组的阳性率均显著高于先后和同时感染组.用PCR和RT-PCR进行了基因鉴定得到一致的结果.结论研究结果提示HV和Ot可重复感染宿主动物,在同一宿主细胞内的感染初期有相互抑制作用,这对HV和Ot的流行病学有一定的理论意义.
-
实时荧光定量PCR检测恙虫病东方体
目的建立检测恙虫病东方体的实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR)方法.方法根据恙虫病东方体56kD外膜蛋白基因序列设计引物和探针,以克隆的56kD基因片段作DNA模板,建立实时荧光定量PCR检测方法.结果建立的荧光定量PCR标准曲线的循环阈值(Ct)与模板拷贝数呈良好的线性关系(r=0.999).荧光定量PCR检测恙虫病东方体的灵敏度约为套式PCR的100倍,并且具有良好的重复性.用该定量PCR检测其它相关立克次体和病原菌DNA样本,检出结果均为0.用该定量PCR检测恙虫病东方体实验感染小鼠的血、脾脏、肺脏、肝脏标本,结果脾脏中东方体出现早和检出量多,肝脏和肺脏次之.血中的恙虫病东方体量较低.结论本研究建立的荧光定量PCR方法具有很高的特异性和敏感性,可用于东方体感染早期血样本的快速检测作恙虫病感染早期诊断,并且可以定量分析评价恙虫病东方体感染的程度.
-
实验室保存的恙虫病东方体Karp株与福建省分离株的sta 56基因的序列分析
目的比较实验室保存的恙虫病东方体Karp株、福建省两个分离株的sta 56基因序列的差异.方法提取感染各株恙虫病东方体的Vero细胞的DNA,扩增出sta 56的ORF.对不同株的ORF进行测序,对15株恙虫病东方体的sta 56构建进化树并进行分析.结果实验室保存的Karp株的sta 56基因序列有98%与参考株一致;FQ株和NA株仅有两个碱基的差异,有96%的序列与Karp株一致.结论实验室保存的Karp株sta 56基因在长期传代中可发生变异,FQ株和NA株均属于Karp株.
-
恙虫病东方体Karp株56kDa与47kDa外膜蛋白基因的嵌合和嵌合基因在大肠杆菌的表达
目的将恙虫病东方体(Orientia tsutsugamushi,Ot)Karp株的56kDa和47kDa外膜蛋白基因嵌合,并使嵌合基因在大肠杆菌细胞内表达,产生双抗原融合蛋白.方法采用PCR方法,从Ot Karp株基因组DNA中扩增56kDa蛋白基因片段,将该片段分别与原核表达载体pQE30及47kD蛋白基因重组质粒 pQE30/47连接,构建pQE30/56及pQE30/56-47重组质粒;用IPTG诱导转入大肠杆菌内的重组质粒的目的基因表达.结果SDS-PAGE显示,pQE30/56转化的大肠杆菌产生一约45kDa的融合蛋白和pQE30/56-47转化大肠杆菌产生一约90kDa融合蛋白(56-47融合蛋白),免疫印迹分析显示两融合蛋白均与Ot Karp株感染鼠血清产生特异性反应,56-47融合蛋白分别与47kDa、56kDa重组蛋白免疫的小鼠血清产生特异性反应,以及56-47融合蛋白免疫血清与56kDa和47kDa重组蛋白反应.结论Ot Karp 株的56kDa与47kDa外膜蛋白基因嵌合后在大肠杆菌细胞内实现了表达,表达的融合蛋白具有56kDa和47kDa外膜蛋白的抗原特性.
-
恙虫病东方体47kDa蛋白基因部分片段的克隆与表达
目的表达恙虫病东方体(Orientia tsutsugamushi,Ot)47kDa保护性抗原蛋白.方法采用PCR方法,从Ot Karp株基因组DNA中扩增出47kDa蛋白基因片段,鉴定后将该片段克隆于原核表达载体pBV220,构建成重组质粒pBV-47.用该重组质粒转化E.coli,转化子在42℃诱导表达并对其鉴定.结果 (1)获得长约1430bp的PCR片段,序列分析结果与已知47kDa基因序列相同;(2)SDS-PAGE检测表达产物,在相对分子量40×103处有表达带;(3)经薄层扫描分析,目的蛋白占全菌蛋白的19%;(4)免疫印迹实验证明其具有免疫反应性.结论获得了47kDa基因片段,并在大肠杆菌中实现了表达,表达产物具有免疫反应性.
-
南澎列岛恙虫病东方体分离株的基因分型
目的用分子生物学技术鉴定南澎列岛恙虫病东方体及其分型。方法以巢式聚合酶链反应（NPCR）检测南澎列岛恙虫病东方体8个分离株的56kD蛋白基因片段，阳性产物进行限制性片段长度多态性分析（RFLP）。选择其中4株的PCR产物克隆进pGEM-T载体并且测序，测序结果在国际互联网作多序列比较和进化树分析。结果 7株分离株扩增出500bp目的片段，RFLP分析表明南澎列岛存在三种不同的恙虫病东方体。从4个样品获得7个克隆，序列分析证实2个克隆(DY1,DY21)与Yonchon同源性99％，3个克隆(DY22,NY12,NS2)与Karp株同源性92％，2个克隆(NY11,NS1)与Kato株同源性98％。结论南澎列岛存在Karp,Kato,Yonchon三种型别的恙虫病东方体。
-
恙虫病东方体CMY株sta56基因片段序列分析
目的了解恙虫病东方体 CMY 株与其它株的关系.方法测定 CMY 株 sta56 基因片段的核苷酸序列并与其它株相应序列进行比较.结果在测定的 324bp序列中,GC 含量为43.5%;与Karp、Gilliam、Kato、kuroki、Kawasaki 及Shimokoshi 株相应序列的同源性分别为91.0%、87.3%、87.0%、87.3%、86.1% 及 73.8%.结论 CMY 株与已报道的恙虫病东方体菌株不同,与 Karp 株有很高的同源性.
-
福建近年恙螨感染恙虫病东方体的检测研究
目的检测恙螨幼虫体内恙虫病东方体,分析福建恙虫病可能流行的趋势.方法从福建山区及沿海地区捕鼠采集恙螨幼虫,通过分类鉴定,以每只鼠体的寄生螨作为一个被检单位,用套式 PCR 扩增恙虫病东方体Sta 58kDa基因的88bp片段,以确定恙螨幼虫是否携带本病原,继而估计该地区是否存在恙虫病疫源地.结果从105份被检单位的恙螨幼虫检出7份恙虫病东方体阳性标本,主要宿主为黄毛鼠,主要媒介为纤恙螨属的地里纤及小板纤恙螨,与有关资料比较,证实本省恙虫病的宿主和媒介未发生明显变化.结论福建沿海地区恙螨的恙虫病东方体的感染率高于山区,疫源地有继续扩大的趋势.
-
湖南老年医院首例恙虫病多器官受累病例实验室分析
目的 对湖南老年医院首例恙虫病可疑病例进行实验室快速诊断及病原分子流行病学分析.方法 病人急性期及恢复期血清恙虫病IgM、IgG抗体进行胶体金快速定性及ELISA定量.环介导等温扩增(LAMP)病人血液及焦痂恙虫病东方体56KD基因及巢氏PCR扩增热休克蛋白基因(groEL)并分析groEL遗传进化关系.结果 病人发热期(发病24天)及恢复期(发病32天)血清IgM、IgG抗体定性试验均为阳性,ELISA定量试验双份血清IgM、IgG抗体滴度均达1∶2 560.急性期血液及焦痂DNA样本LAMP检测及巢氏PCR扩增groE阳性.结论 本报道为湖南老年医院首例恙虫病病例报道.应加强立克次体病诊断及鉴别诊断.
-
新疆博乐地区恙虫病东方体自然疫源地调查
目的 调查新疆博乐地区恙虫病东方体自然疫源地情况.方法 采用捕鼠取脾,鼠体表捕螨,当地牧民静脉取血等收集样本,用试剂盒提取样本DNA,应用巢式PCR(nPCR)检测东方体基因(Sta56).结果 在博乐地区平原湿地区捕鼠126只,其中7只nPCR检测为阳性(阳性率5.55％)；从当地牧民300份血液中nPCR检测6份为阳性(阳性率2.0％)；野鼠体表带螨率为8.4％,从捕获博乐纤恙螨中nPCR检出阳性.DNA序列分析表明,鼠类、人血及恙螨中检出的基因序列相同,与东方体Karp株Sta56基因序列同源性为99％.在山地草原捕获鼠58只和捕获旱獭26只,nPCR检测其样本均为阴性,从鼠体表未捕获到恙螨.结论 新疆博乐地区平原湿地存在恙虫病东方体自然疫源地,小家鼠、普通仓鼠、大沙土鼠为其宿主动物,纤恙螨为当地恙虫病的传播媒介.
-
福建省北部林区人群人粒细胞无形体血清流行病学检测
目的 了解福建省北部林区人群人粒细胞无形体病感染状况与分布特点,以及无形体与莱姆病、恙虫病重叠感染的情况,为林区人群无形体的预防提供科学依据.方法 2007年7月开始在福建省武夷山林区采集林业工人、农民和干部等269份血清,用试剂盒采用间接免疫荧光法(IFA)检测人粒细胞无形体、莱姆病和恙虫病抗体,并进行不同地区、年龄、性别、职业分布比较.数据库建立和统计分析均采用SPSS14.0,χ2检验的显著性水平α=0.05.结果 269份血清中检出46份人粒细胞无形体血清抗体阳性,阳性率17.10%.人粒细胞无形体血清抗体除年龄外不存在地区、性别、职业差异.46份人粒细胞无形体抗体阳性的血清中检测到1份与莱姆病混合感染,9份混合感染了莱姆病和恙虫病病原体.结论 福建省武夷山林区人群存在人粒细胞无形体感染,并且是莱姆病、恙虫病重叠流行区.在林区人粒细胞无形体病、莱姆病、恙虫病三者的防治应同时进行.
-
检测恙螨幼虫体内恙虫病东方体DNA用于监测恙虫病流行病学分析
目的了解恙螨幼虫体内恙虫病东方体自然感染率与恙虫病流行的关系，为恙虫病的监测与防治提供理论依据。方法 1974～1982年福建省49个点捕获的野鼠体表采集恙螨幼虫91093只，同种为一组用乙醇保存，以10～50只为一份，用东方体56kDa基因所构进的引物进行PCR扩增。将结果与90年代捕获的恙螨幼虫PCR检测结果比较，结合相应年代的恙虫病发病情况进行分析。结果 1974～1981年捕获地里纤恙螨29份、小板纤恙螨9份，高潮纤恙螨3份、苍白纤恙螨12份、于氏纤恙螨1份、中华无前纤恙螨1份，PCR检测恙螨幼虫体内东方体DNA均为阴性。1982年12月采集的小板纤恙螨1份，1991年6-7月采集的地里纤恙螨1份，检测到东方体DNA。结果表明1982年前恙螨幼虫体内东方体自然感染率极低。结论恙螨幼虫体内东方体的自然感染率高低与恙虫病流行有密切关系。
