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恙虫病东方体合肥分离株截短56 kDa蛋白抗原表达及活性分析
本文获得恙虫病东方体合肥分离株截短56 kDa外膜蛋白基因工程纯化抗原,并鉴定其免疫学活性,为进一步研制广谱诊断试剂、疫苗以及分析其在东方体致病的分子机制奠定基础.我们通过DNAStar和Mega等软件对含有440个氨基酸的合肥株56 kDa蛋白序列进行抗原性分析;将合肥株56 kDa截短蛋白基因克隆至原核表达载体pET28a获重组质粒,转入大肠杆菌E.coli BL21感受态中,经IPTG诱导,SDS-PAGE电泳分析检测蛋白表达;采用亲和层析法纯化目的蛋白,Western-blot及ELISA法鉴定其免疫学活性.序列分析发现合肥分离株56 kDa蛋白可分为4个保守区和3个可变区,抗原性分析结果显示,其保守区的亲水性和抗原性均有很高峰值.SDS-PAGE电泳显示约56 kDa的目的重组蛋白表达条带,Western-blot分析显示该重组蛋白可与恙虫病病人血清反应,阴性血清则未出现相应印迹,ELISA分析结果显示该蛋白低浓度为80 ng/μL时仍可检出阳性血清;5μg/mL蛋白可检测阳性血清滴度高达1∶12 800,证实其具有较强反应原性.本实验获得恙虫病东方体合肥株56 kDa截短外膜蛋白基因工程抗原具有良好的抗原活性,有望进一步应用于恙虫病的诊断、疫苗研制及致病机制分析.
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新疆伊犁那拉提草原啮齿动物感染恙虫病东方体调查
为了解新疆伊犁那拉提草原啮齿动物中自然感染恙虫病东方体(Ot)的情况,在那拉提草原捕获鼠和旱獭,分别取其脾组织提取DNA,应用巢式PCR(nPCR)方法检测Ot-Sta56基因;基因分型引物扩增阳性片段,判断该地区存在的Ot基因型,部分阳性标本测序,通过NCBI网站对序列进行BLAST比较分析.结果显示,在该地区共捕获鼠67只,旱獭29只,在其中3只鼠、2只旱獭的脾中检测到阳性片段,基因型包括Karp型、Saitama型,BLAST结果显示其中1个片段的核苷酸序列与Karp型同源性为97%,另1个片段未能测出核苷酸序列.推测在那拉提地区鼠类可能感染Ot,基因型为Karp型,怀疑可能有Saitama型存在.
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恙虫病东方体三种膜蛋白抗原包被酶联免疫吸附试验的特异性和敏感性分析
用恙虫病东方体的r47、 r56、 r58 kDa重组膜蛋白抗原包被建立酶联免疫吸附试验（ ELISA ），对恙虫病东方体实验感染小鼠血清和临床患者血清做IgG抗体检测。8份恙虫病感染小鼠血清中除1份血清与r58 kDa蛋白的反应阴性外其他反应均为阳性；而这3个重组蛋白与贝氏柯克斯体（ Q热病原体）、莫氏立克次体（地方性斑疹伤寒病原体）、黑龙江立克次体（远东斑点热病原体）感染小鼠血清反应均为阴性。另外，12份恙虫病患者血清对这3个蛋白的反应均有11份（92％）为阳性。另外， r47 kDa抗原对11份Q热患者血清、11份斑疹伤寒患者血清、13份斑点热患者血清的反应阳性率分别有27％、18％、23％，对r56 kDa抗原分别为27％、0％、8％，对r58 kDa抗原分别为18％、18％、23％。这些结果显示这3个重组蛋白抗原均有识别恙虫病东方体感染血清的良好特异性和敏感性，用这3种重组蛋白抗原建立的ELISA将为我国恙虫病血清学诊断提供新的实用方法。
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恙虫病并发心脏损伤的临床分析
目的 探讨恙虫病并发心脏损伤的临床表现及影响预后的因素.方法 回顾性分析1985年6月至2012年8月本院收治的200例恙虫病患者的临床资料,包括主要临床表现、血清外斐试验、心肌酶谱和心电图检查结果等.所有患者按确诊时间长短分为确诊时间＜7d组、确诊时间7～13d组和确诊时间≥14d组3组,按年龄分为＜60岁组和≥60岁组2组,分析患者确诊时间和年龄对患者心脏损伤及预后的影响.结果 200例恙虫病患者大多数出现符合恙虫病的典型临床表现,其中33例(16.5％)出现心悸、胸闷,20例(10.0％)发生急性左心功能衰竭;153例(76.5％)出现1项或多项心肌酶活性升高,以乳酸脱氢酶(LDH)升高常见;111例(55.5％)出现心电图异常,少数患者发生高危性心律失常.与确诊时间≥14 d组比较,确诊时间＜7d组患者的死亡比例显著降低(1.5％比15.4％,P＜0.05).与年龄＜60岁组比较,年龄≥60岁组患者心电图异常及死亡比例显著升高(64.7％比48.7％,12.9％比2.6％,均P＜0.05).结论 恙虫病患者并发心脏损伤的比例较高,其预后与确诊时间和患者年龄有关联.
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广东省重要岛屿恙虫病东方体血清流行病学调查
目的 在广东省5岛屿开展恙虫病东方体血清流行病学调查并进行血清分型,为制定恙虫病防治策略提供依据. 方法 1998年5月～2003年8月在广东省南澎列岛、南澳岛、万山群岛、硇洲岛和雷州半岛等岛屿采集驻岛官兵、居民及啮齿动物血清,采用免疫荧光法检测抗体并进行血清学分型. 结果 687份人血清中抗恙虫病抗体阳性95份,阳性率13.83%,其中岛屿居民抗体阳性率为26.91%,军人为3.63%,差异有统计学意义(P＜0.05).检测508份鼠血清,抗恙虫病东方体抗体阳性率为57.87%,其中褐家鼠为有时鼠种.恙虫病东方体血清型以Karp株为主,占50.90%. 结论 广东省5岛屿均为恙虫病疫源地,恙虫病东方体血清型以Karp株为主.
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恙虫病东方体环介导恒温扩增可视化快检方法的建立
目的 建立快速检测恙虫病东方体(Orientia tsutsugamushi,Ot)的环介导恒温扩增技术(Loop-mediated isothermal amplification,LAMP),以期用于基层医院及疫区恙虫病快速筛查. 方法 以恙虫病东方体56 ku外膜蛋白基因为检测靶序列,设计2组恒温扩增引物,筛选佳引物,优化反应条件,对多种培养物中的Ot标准株及地方株进行验证检测,以经典PCR检测为对照,评估LAMP检测方法的敏感性和特异性. 结果 建立的LAMP法可快速检测鸡胚培养物、动物脏器及病人血样中的Ot DNA,经63℃恒温扩增1h之后,即可肉眼或用浊度仪观察结果,其他5种立克次体DNA模板对照,均无特异性扩增.LAMP法测定Ot DNA的低限为5.3×101拷贝/反应,普通PCR法为5.3×104拷贝/反应,LAMP法比普通PCR提高约3个数量级. 结论 建立的LAMP法能快速检测多种样品中的Ot 56 ku基因,方法的灵敏度和特异性高,实现了检测的可视化,适用于基层医院及疫区恙虫病筛查.
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套式PCR应用于恙虫病东方体媒介、鼠类血块及脾脏标本的实验检测研究
目的:检测恙螨幼虫体内及鼠类标本中恙虫病东方体携带情况,预测流行趋势,评价套式PCR反应的敏感性和特异性,以进一步开展分子流行病学研究.方法:参照文献中恙虫病东方体Karp株Sta 58群特异性抗原基因序列,合成两对DNA引物;应用套式PCR检测现场鼠体表恙螨幼虫体内及鼠类标本的恙虫病东方体DNA;PCR扩增产物通2%琼脂糖凝胶电泳分析和12% PAGE电泳分析,并用PGEM-3Zf(+)/HaeⅢ DNA作为核酸分子量参照物,证实扩增产物是恙虫病东方体Sta 58kDa群特异性抗原基因88bp片段.结果:从送检的29份鼠血块和112份脾组织中均检出阳性1份;从39份恙螨幼虫体内检出阳性8份.实验感染小鼠后3d,其血块及脾组织均未检出恙虫病东方体;而在感染后6和9d,能从血块及脾组织中检出恙虫病东方体.结论:套式PCR具有很高的敏感性和特异性,是疫源地及现场流行病学调查的有效手段.
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黑龙江省庆安县小兽体表恙螨及恙虫病东方体感染调查
目的 调查黑龙江省绥化市庆安县山地和平原地区小兽体表寄生恙螨和恙虫病东方体的感染情况.方法 于2013年9月利用夹夜法捕获小兽,鉴定种类并梳检小兽体表恙螨,对恙螨种类进行鉴定并计算恙螨指数;无菌解剖小兽肝、脾等脏器,低温保存,提取其DNA,采用巢氏PCR扩增恙虫病东方体56 kD表面蛋白基因.结果 共捕获小兽107只,包括啮齿目和食虫目共9种;农村居民区室外以黑线姬鼠为主,室内仅捕获褐家鼠和小家鼠;农田以黑线姬鼠为主,林区以黑线姬鼠和朝鲜姬鼠为主;小兽体表共检获1 164只恙螨,包括高丽新恙螨、东方纤恙螨、日本新恙螨和亚中纤恙螨;林区的棕背鼠平恙螨指数高,为65.50,大仓鼠、红背鼠平和花鼠次之,分别为58.13、22.86和24.00;距林区较远的农田和居民区小兽体表未发现恙螨.山区大仓鼠和朝鲜姬鼠各1只经PCR恙虫病东方体核酸检测为阳性.结论 庆安县小兽及其体表恙螨种类与东北北部其他地区类似,鼠类中检出恙虫病东方体,该地区是新发现的恙虫病自然疫源地,应开展人群流行病学调查.
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鲁中南丘陵地区鼠类生态学及其医学意义研究
目的搞清鲁中南丘陵地区鼠类生态学及其医学意义.方法采用生态学、流行病学和血清学方法.结果 (1)对鲁中南丘陵地区农田鼠类构成及季节消长常年系统的观察结果表明,当地农田优势鼠种为黑线姬鼠,大仓鼠为常见种.鼠类总密度变化全年有2个数量高峰,前峰在7月,后峰在10月,黑线姬鼠密度变化与鼠总密度类似,但其后峰高于前峰.大仓鼠全年仅1个数量高峰在7月中旬.(2)黑线姬鼠全年有2个繁殖高峰,分别在5月和9月;大仓鼠仅1个繁殖高峰在5月,随鼠龄增加,雌鼠怀孕率增加,雄鼠睾丸下位率亦增加,且下位率变化与雌鼠繁殖活动变化基本一致.(3)多元回归分析和逐步回归分析表明,相对湿度是影响黑线姬鼠和大仓鼠种群密度变化的主要气象因子.(4)黑线姬鼠、大仓鼠、褐家鼠均存在汉坦病毒(HV)和恙虫病东方体(Ot)自然感染,其季节消长与肾综合征出血热及恙虫病的发病率变化密切相关.
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TaqMan-MGB探针实时荧光定量PCR检测恙虫病东方体方法的建立
目的 建立敏感、特异、定量Real-timePCR方法,用于恙虫病东方体的检测.方法 根据恙虫病东方体56 kD外膜蛋白基因序列设计引物和探针,建立实时荧光定量PCR检测方法.结果 建立的TaqMan-MGB探针具有良好的特异性,建立的荧光定量PCR标准曲线的循环阈值(Ct)与模板拷贝数呈良好的线性关系(r=0.99),灵敏性评估发现每个20μlPCR反应管中只要有26个拷贝的目的基因即可被检测到,即低检出浓度为2拷贝/μl,并且具有较好的重复性.结论 建立的荧光定量PCR方法具有很高的特异性和敏感性,可用于恙虫病东方体感染的快速检测.
关键词： 恙虫病东方体 实时荧光定量PCR TaqMan-MGB探针 -
巢式PCR及序列分析用于攀枝花市恙虫病东方体检测
目的 对采集自攀枝花市的疑似恙虫病患者血液样本进行实验室检测,了解攀枝花地区恙虫病东方体感染情况,同时为四川省恙虫病早期诊断提供依据.方法 运用巢式PCR对2013年7-10月采集自攀枝花市的48份疑似恙虫病患者全血样本中提取的基因组DNA进行恙虫病东方体sta-58编码基因检测;随机挑取2份阳性样本进行恙虫病东方体sta56基因片段扩增、测序及序列分析.结果 48份样本中,巢式PCR检测阳性的样本18份;2份样本均扩增到恙虫病东方体sta56基因片段,其序列同源性为96％,系统进化分析显示该2株恙虫病东方体均与某些恙虫病东方体台湾株位于同一个分支,同时与Karp株位于同一个分支.结论 在四川省范围内首次运用巢式PCR法检测恙虫病东方体,实验室确诊攀枝花市存在恙虫病的感染,攀枝花市部分恙虫病患者由恙虫病东方体Karp型感染,在遗传进化上与某些台湾恙虫病东方体株关系密切.
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2013年北京地区小兽中3种病原携带状况调查
目的：了解恙虫病、莱姆病、巴贝西虫病3类疾病病原体在北京市各区小兽中的感染及分布情况。方法2013年4－10月，采用夹夜法捕获小兽并解剖获取其组织样本，采用普通PCR与实时荧光定量PCR方法，检测小兽组织中恙虫病东方体、伯氏疏螺旋体以及巴贝西虫的特异性目的基因。结果2013年北京地区500份小兽样本中恙虫病东方体阳性率为2.40%，来自6个区，以海淀区高（21.43%），其他区恙虫病东方体感染率为2.04%～5.00%；巴贝西虫阳性率为6.40%，来自11个区，以海淀区高（21.43%），其他区巴贝西虫感染率为1.96%～16.67%；检出恙虫病东方体与巴贝西虫共同感染样本4份，复合感染率为0.80%；所有样本中均未检测到伯氏疏螺旋体。结论北京地区小兽中恙虫病东方体的感染不仅局限于发现病例的地区，应进一步加强全市人间病例以及宿主和媒介的监测工作，巴贝西虫小兽间感染在分布范围和感染率方面均高于恙虫病东方体，应加强对基层医生的培训并及时开展高危人群的监测与健康教育。
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我国雷州半岛恙虫病疫源地的特点
目的 了解雷州半岛恙虫病疫源地的现状,为防治提供依据.方法 疫源地流行病学调查,宿主与媒介的生态调查,病原分离与基因检测.结果 该地区为南亚热带岛屿疫源地,主要宿主为褐家鼠,主要媒介为地里纤恙螨.从宿主与媒介分离到恙虫病东方体,经基因鉴定为 Karp 株.血清流行病学调查表明该岛农村居民恙虫病抗体阳性率22.06%,部队人群抗体阳性率3.64%.结论 雷州半岛是我国重要的恙虫病疫源地,部队人群尤其要做好防护.
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恙虫病东方体Karp株47kD蛋白基因的表达及DNA免疫初步研究
目的观察恙虫病东方体Karp株相对分子质量(Mr)为47×103蛋白基因的DNA免疫效果. 方法将恙虫病东方体Karp株Mr为47×103的蛋白基因插入真核表达载体pcDNA3.1(+),构建重组质粒pcDNA3.1/47.在证明该重组质粒可在哺乳动物COS7细胞中表达的基础上,单独和将其与Mr为40×103重组蛋白联合免疫小鼠.在每次加强免疫之后10?d,检测小鼠体液和细胞免疫反应. 结果质粒DNA和蛋白联合免疫组所诱导的抗体水平和脾淋巴细胞增殖反应均高于重组质粒DNA和蛋白单独免疫组,而第二次加强免疫后重组质粒诱导脾淋巴细胞的增殖情况则显著弱于其它免疫组(P＜0.05). 结论重组质粒pcDNA3.1/47和重组Mr为47×103蛋白在刺激小鼠免疫反应上具有相互加强作用.
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恙虫病东方体Sta56抗原的原核表达、纯化及其在间接ELISA中的应用
目的构建含恙虫病东方体sta56基因的重组表达质粒,在E.coli中表达Sta56重组抗原,纯化后用于间接ELISA检测恙虫病. 方法从含有恙虫病东方体Karp株sta56基因的重组质粒TOPO-sta56扩增出截短的sta56,定向插入pET30a载体,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达,用SDS-PAGE及Western blot进行分析;采用电洗脱方法纯化重组抗原并应用于间接ELISA检测恙虫病. 结果以截短的sta56基因片段构建了重组表达质粒pETOt957,重组的Sta56抗原可在E.coli中以融合蛋白的形式有效表达,SDS-PAGE显示了一条相对分子质量(Mr)为40.3×103的蛋白表达带,Western blot证实该融合蛋白能被恙虫病患者阳性血清所识别.电洗脱纯化的重组抗原应用于间接法ELISA检测恙虫病,与间接免疫荧光法IFAT比较,其敏感性和特异性分别为91.7%和76.5%. 结论在大肠杆菌中表达的Sta56重组抗原具有免疫反应性,纯化后可用作免疫诊断试剂.
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恙虫病东方体Sxh951株56kD蛋白的表达及其在ELISA中的应用
目的构建含Orientia tsutsugamushi Sxh951株(Ot. Sxh951)相对分子质量(Mr)为56×103外膜蛋白基因(sxh56)的重组质粒pQE30/56,表达Mr 56×103蛋白并观察其在ELISA中的应用. 方法 IPTG诱导sxh56重组质粒;观察SDS-PAGE和免疫印迹结果;经Ni-NTA亲和层析纯化后的重组蛋白分别与Ot. Gilliam、Ot. Karp、Ot. Kato感染鼠血清进行ELISA和免疫印迹检测. 结果 SDS-PAGE和免疫印迹检测显示有一Mr约为56×103的特异蛋白带;ELISA和免疫印迹结果显示该重组蛋白只与Ot. Gilliam感染鼠血清呈阳性反应;重组蛋白用作ELISA包被抗原检测小鼠血清抗体IgG,特异性为100%,敏感性96.67%;检测人血清抗体IgG的敏感性为88.08%,特异性96.36%. 结论表达的重组Sxh56蛋白具有良好的免疫反应性;其作为ELISA包被抗原,具有良好的特异性和敏感性.
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珠海市88例恙虫病临床特征分析
目的：分析珠海市恙虫病的临床特点，提高临床诊断及治疗水平。方法回顾性分析珠海市88例恙虫病患者的临床资料，探讨其临床特点。结果65例患者（73.86%）发病前有草地/树林接触史。临床表现主要有发热（100%）、头痛（63.64%）、乏力（39.33%）、咳嗽（35.23%），淋巴结肿大（47.73%）、肝脾肿大（35.22%）、皮疹（29.55%）及特异性焦痂/溃疡（95.45%）等。外周血白细胞计数多正常（71.59%），可伴有嗜酸性粒细胞减少（78.41%）、血小板减少（38.64%），合并肝损害多见（87.5%）。共有84例患者送检外斐试验98例次，变形杆菌OXK凝集反应阳性效价12例次，阳性率12.24%。氯霉素、米诺环素、多西环素、克拉霉素治疗均有效。结论恙虫病临床表现多样，常累及多个系统，焦痂/溃疡为其具诊断价值的特异体征，需仔细查体以免误诊。外斐试验阳性率低，不能单独做为诊断依据。氯霉素、四环素类及大环内酯类抗生素治疗效果好。
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恙虫病基础和临床诊治研究进展
对恙虫病防治基础和临床研究新进展进行综述,为提升恙虫病防治水平提供理论依据.通过万方数据、维普网、中国知网以"恙虫病"为检索词,检索时间为2015年1月至2017年6月,检出文章共238篇.对检出文献进行筛查、整理、综合、综述,发现恙虫病发病率近年来急剧升高,但医务人员对其认识不足,导致误诊、误治发生率高.医务人员特别是基层和非疫区医务人员对该病认知不足,病史询问和体检不详细;确诊方法阳性率低、特异性差.提高对恙虫病发病的认识,恙虫病的热型为稽留热、弛张热,热度为高热或超高热;仔细查体寻找焦痂、皮疹是减少误诊的首要步骤;通过恙虫病东方体检测、恙虫病东方体IgM检测为确诊恙虫病的关键;血常规(白细胞总数下降、嗜酸性粒细胞下降)、降钙素原(升高)、多器官功能损害证据等对恙虫病确诊具有重要意义.
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阜阳市疑似恙虫病患者和恙螨及恙虫病鼠类中东方体分离及基因分型研究
目的 分析从患者全血 、恙螨 、野鼠肝脾等标本中分离的恙虫病东方体,为进一步确立阜阳市为新疫源地提供依据.方法 采集2009年-2010年每年9月-11月辖区内疑似患者抗凝血 、野鼠 、恙螨标本,利用小白鼠传代分离法,分离恙虫病东方体,通过巢式PCR方法检测,对其测序结果 进行基因分型.结果 患者新鲜血液或抗凝血标本在传至3代 ～4代以后,小白鼠肝脾组织标本核酸检测结果部分为阳性(全血PCR阳性59组,经小白鼠分离后15株阳性;恙螨20组,其中3组PCR阳性,经小白鼠分离后1株阳性;野鼠256只,其中7只PCR阳性,经小白鼠分离35组,其中1株阳性),取扩增产物进行序列分析,证实为恙虫病东方体kawasaki基因型.结论 首次从秋冬型恙虫病东方体流行季节患者 、野外优势鼠种黑线姬鼠以及小盾纤恙螨体内分离的病原体为恙虫病东方体,进一步从病原学上证实阜阳市为新的疫源地.
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南澎列岛恙虫病东方体分离株的PCR/RFLP分析
目的为确定我国南澎列岛是否为恙虫病疫源地,对来自该地的8个恙虫病东方体分离株进行基因鉴定.方法应用套式聚合酶链反应(NPCR)和限制片段长度多态性分析(RFLP),NPCR的引物来自恙虫病东方体56kDa蛋白基因,NPCR阳性产物由HincII和PstI消化并产生特异性酶切图谱并予以分析.结果南澎列岛的8个恙虫病东方体分离株属三个型,即Karp,Kato和一新型恙虫病东方体.结论南澎列岛是恙虫病疫源地.
关键词： 恙虫病东方体 聚合酶链反应 限制片段长度多态性分析
