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2010～2011年乌鲁木齐地区住院呼吸道感染患儿人博卡病毒检测与分析
目的 了解新疆乌鲁木齐地区住院呼吸道感染患儿中人博卡病毒(human bocavirus,HBoV)的检出情况.方法 收集新疆维吾尔自治区人民医院2010年1月至2011年12月住院呼吸道感染患儿鼻咽抽吸物标本525例,用巢氏PCR扩增人HBoV NS1片段检测HBoV 1 ～4型.结果 在525份标本中,HBoV总阳性检出率为8.38％ (44/525),其中HBoV 1型6例,HBoV 2型38例,未检出HBoV 3、4型.各民族患儿之间HBoV阳性检出率统计分析发现,维族、回族患几分别高于汉族患儿,差异有统计学意义(P＜0.05).HBoV 1型与参考株核苷酸序列相似度为97.7％ ～ 99.4％,HBoV2型与参考株核苷酸序列相似度为93.6～ 100％.HBoV的检出时间主要以冬春季为主,HBoV感染在年龄及性别方面差异均无统计学意义.结论 2010～ 2011年乌鲁木齐地区呼吸道感染的住院患儿存在HBoV 1、2型的流行,以HBoV 2型为主,维族、回族患儿HBoV的检出率分别高于汉族患儿.
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脑瘤手术患者咽喉部吸取液中耶氏肺孢子菌的筛查
目的 采用常规PCR、巢式PCR(Nest PCR,nPCR)和定量PCR(Quantitative PCR,qPCR)检测耶氏肺孢子菌(Pneumoc ystisjirovecii,Pj)特异性核酸片段,调查脑瘤手术患者咽喉部吸取液中的Pj. 方法 选取无肺炎脑瘤手术患者108例,留取手术咽喉部吸取液,分别以线粒体大亚基rRNA(Mitochondrial large subunit rRNA,mtLSUrRNA)为靶基因的常规PCR(Mt-PCR)和巢氏PCR(Mt-nPCR),以及主要表面糖蛋白(Major surface glycoprotein,Msg)为靶基因的常规PCR(Msg-PCR),检查咽喉部吸取液中Pj特异性核酸片段,阳性标本进行qPCR,检测分别以mtLSUrRNA和Msg为靶基因的拷贝数. 结果 108例脑瘤手术患者咽部吸取液Mt-nPCR、Msg-PCR及MtPCR扩增阳性率率分别为41.7％(45/108)、15.7％ (17/108)和4.6％(5/108),其中3种检测方法同为阳性1例(占0.9％),任意2种方法阳性11例(占10.2％),Mt-nPCR和Msg-PCR任意1种方法阳性42例(占38.9％),3种方法均阴性54例(占50.0％).54例PCR检测阳性的标本同时进行mtLSUrRNA定量PCR(Mt-qPCR)和Msg定量PCR (Msa-qPCR)检测,其中Mt-qPCR检测为100～999拷贝/μl2例(占3.7％),1 000～9 999拷贝/μl有49例(占90.7％),≥10 4拷贝/μl有3例(占5.6％);Msg-qPCR检测为1 000～9 999拷贝/μl 14例(占25.9％),10 000～99 999拷贝/μl 21例(占38.9％),100 000～999 999拷贝/μl 14例(占25.9％),≥106拷贝/μl有5例(占9.3％).54例中Msg-qPCR拷贝数＞Mt-qPCR拷贝数51例(占94.4％),Msg-qPCR拷贝数＜Mt-qPCR拷贝数3例(占5.6％). 结论 核酸扩增法检测脑瘤手术患者咽喉部吸取液Pj阳性率为50.0％,其中MtqPCR检测多数为103拷贝/μl,Msg qPCR检测多数为103～105拷贝/μl,解读需谨慎.
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艾滋病患者感染HIV-1病毒的gag、 env和pol基因变异研究
目的 通过巢式聚合酶链式反应和菌落聚合酶链式反应检测艾滋病患者感染HIV-1病毒的gag、env和pol基因变异情况,为艾滋病的临床治疗提供参考. 方法 采集HIV-1艾滋病患者全血标本,提取HIV-1 cDNA,进行巢式PCR和菌落PCR,并测序. 结果 巢式PCR检测70份全血标本HIV-1病毒gag、env、pol基因,分别有50、44和59份阳性,电泳检测3种基因巢式PCR产物分别为650、650和1 100 bp.挑取阳性克隆体进行菌落PCR,扩增产物大小分别为750、750和1 200 bp.分析3种基因序列,有两份标本gag基因在其片段尾部第118和119位间插入一个氨基酸;env基因的V3环顶端存在6种四肽序列变异方式,即GPGR、GPGQ、GQGR、GPGA、GLGR、GPGK; pol基因在PR区的第40位发生了氨基酸突变,即由TGG变异为TAG,在其第52位同样也发生了突变,由GGT变异为AGT,而在RT区第153位发生了无义突变,即突变为终止密码子. 结论 本地区艾滋病患者感染HIV-1病毒的gag、env和pol基因均发生了不同程度的突变,可供治疗时参考.
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2012年河南省疟疾标本的实验室检测分析
目的 比较疟疾实验室检测方法,分析疟疾标本的检测结果. 方法 分别用吉氏染色镜检、巢氏PCR和序列分析方法对2012年河南省收集的165份疟疾标本进行检测,并对检测方法及结果进行分析比较. 结果 综合分析镜检、巢氏PCR和序列分析等3种方法的检测结果,165份疟疾标本的阳性率为93.94％,其中镜检和巢氏PCR阳性率分别为87.88％和90.30％;两种方法对疟原虫虫种的误判率为10.32％,其中对间日疟原虫、卵形疟原虫和三日疟原虫的误判率分别为42.86％、40.00％和28.57％,而对恶性疟原虫的误判率为0.85％. 结论 姬氏染色镜检和巢氏PCR两种方法在疟疾检测中各有优缺点,建议2种方法结合使用以提高疟疾诊断的准确率.
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乌鲁木齐地区腹泻患儿中人博卡病毒感染分子流行病学调查
目的 了解新疆乌鲁木齐地区腹泻患儿中人博卡病毒1～4型(HBoV1 ～4)感染的分子流行情况.方法 收集新疆维吾尔自治区人民医院2011年1月至12月住院及门诊腹泻患儿粪便标本315例,用巢氏PCR扩增入博卡病毒(HBoV) NS1片段(518 bp),检测HBoV1～4型.结果 315份标本中,HBoV总阳性检出率为8.57％ (27/315),其中HBoV1、2、3、4型分别为2例、22例、3例、0例.除XJ1378外,其他26例HBoV均与参考株的核苷酸同源性达到98％ ～ 100％,但其中3例HBoV3型与大猩猩GBoV1型(HM145750.1)核苷酸同源性为92％,且系统进化显示HBoV3型NS1片段更接近于HBoV1型.HBoV感染呈全年散发,并无明显季节性.在性别、年龄及民族间均无差异.结论 本地区腹泻患儿中HBoV1 ～3型均有流行,且以HBoV2型为主要流行株.
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8例输入性卵形疟不同亚型的鉴定
目的 鉴定并分析境外输入性卵形疟的2种亚型及其感染的临床特点.方法 对在北京友谊医院2015年1月 —2017年3月确诊的8例输入性卵形疟患者进行虫种亚型的鉴定,并分析比较不同亚型感染引起的实验室指标的差异.结果 通过对8例患者进行巢氏PCR鉴定及序列分析,结果显示卵形疟curtisi及卵形疟wallikeri亚型各4例;与curtisi亚型感染相比,wallikeri亚型感染后引起血小板下降程度更低,乳酸脱氢酶及TBIL的上升程度更高.结论 输入性卵形疟的亚型鉴定须通过巢氏PCR鉴定完成,wallikeri亚型感染导致的器官损害更为严重.
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微滴数字聚合酶链反应检测婴儿唾液中变形链球菌和远缘链球菌的研究
目的 使用微滴数字PCR检测婴儿口腔内变形链球菌和远缘链球菌,评价其可行性.方法 以变形链球菌c型和远缘链球菌ATCC 27607标准菌株基因设计引物,对123名5~8个月婴儿唾液样本分别进行微滴数字PCR、巢氏PCR和常规PCR反应,检测婴儿唾液中变形链球菌和远缘链球菌.结果 微滴数字PCR定性、定量检测变形链球菌和远缘链球菌标准菌,1×10-4 ng/μl靶细菌的拷贝数达到4.8×104和3.6×104,灵敏度可达0.01%;巢氏PCR检测灵敏度为0.01%;常规PCR检测灵敏度为0.1%.用微滴数字PCR、巢氏PCR和常规PCR检测婴儿唾液中变形链球菌检出率分别为78.9%、33.3%和6.5%;远缘链球菌检出率分别为11.4%、4.1%和0,微滴数字PCR检出率明显高于常规PCR和巢氏PCR(P<0.05).结论 微滴数字PCR能早期检测婴儿口腔中变形链球菌和远缘链球菌,该方法具有较高的灵敏性和特异性,有广泛的临床应用前景.
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肺血管处理顺序对癌细胞入血的影响及临床意义
目的 探讨肺癌根治术中肺血管处理顺序对癌细胞入血的影响.方法 选择56例手术治疗的非小细胞肺癌患者,术前随机分为两组,即先结扎肺静脉者(静脉组)和先结扎肺动脉者(动脉组);术前1天和术后第7天分别采集患者的外周静脉血,用巢氏PCR法检测外周静脉血中人细胞角蛋白19(CK-19)mRNA、癌胚抗原(CEA)mRNA的表达情况.另外选取同期10例健康成年人(健康组)的外周静脉血做对照.结果 术前动脉组和静脉组患者外周血CK-19 mRNA、CEA mRNA的表达率与健康组比较,差异均有统计学意义(P＜0.01),而动脉组和静脉组比较差异均无统计学意义(P＞0.05).晚期肺癌与早期肺癌患者CK-19 mRNA、CEA mRNA的表达率间差异有统计学意义(P＜0.05);腺癌与鳞癌间差异有统计学意义(P＜0.05);术后与术前间差异有统计学意义(P＜0.01);静脉组与动脉组间差异有统计学意义(P＜0.01).结论 肺癌根治术中先结扎肺静脉可减少癌细胞入血;CK-19 mRNA和CEA mRNA可以作为检测肺癌外周血中癌细胞的指标.
关键词： 非小细胞肺癌 CK-19 mRNA CEA mRNA 巢氏PCR 肺血管结扎顺序 -
青海高原地区婴幼儿腹泻病例中检出G9型A组轮状病毒
目的:对2010年西宁地区秋冬季婴幼儿病毒性腹泻病例进行监测,分析青海省A组轮状病毒主要流行株.方法:采集婴幼儿腹泻病例粪便标本,实验室采用巢氏PCR方法对标本进行A组HRV检测.结果:25例A组轮状病毒感染病例中G3型14例,G9型11例,分别占阳性病例的56％和44％.结论:2010年西宁地区婴幼儿腹泻病例中检出G9型A组轮状病毒,近年来各地报道较多的G9型A组轮状病毒将要或已经成为青海省重要的流行株.
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在孕9周前检测孕妇外周血中胎儿的性别
目的 评价使用孕妇外周血中的胎儿细胞和游离DNA进行无创伤性产前诊断的可能性.方法 研究对象为150名孕5～9周的孕妇.使用淋巴细胞分离液和3%的明胶分离胎儿细胞.使用荧光定量PCR(FISH)检测母血中胎儿细胞Y染色体的末端.同时使用巢氏PCR和荧光定量PCR(FQPCR)检测150名孕妇血浆中的胎儿SRY基因.结果 FISH、巢氏PCR以及FQ-PCR 3种方法的敏感性分别为73.2%、78%和85.4%,特异性分别为96.2%、100%和100%.使用FISH,早在孕49d检测到胎儿细胞,使用巢氏PCR和FQ-PCR早在孕49d和42d检测到孕妇血浆中的胎儿游离DNA.结论 3种方法对无创伤性产前诊断都是适合的,其中FQ-PCR因其检测时间较早而成为优选择.
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三例输入性卵形疟的实验室诊断
目的：分析3例输入性疟疾的实验室诊断，减少卵形疟的误诊与漏诊。方法采用形态学检查、巢氏聚合酶链反应（PCR）及序列分析等方法确诊3例输入性疟疾病例。结果3例患者形态学检查结果分别是未检出疟原虫（实验室初次检查）、检出卵形与恶性疟原虫和检出卵形疟原虫；巢氏PCR检测结果依次是卵形疟原虫感染、卵形与恶性疟原虫混合感染和卵形与间日疟原虫混合感染。结论需加强疟疾消除地区疟原虫形态学检查技术的培训和推广。应用分子生物学检查技术可减少输入性卵形疟的误诊与漏诊。
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河南省3例输入性三日疟的诊治分析
采用吉氏染色镜检、CareStartTM疟疾快速诊断试剂盒和巢式PCR等3种方法,对2011年河南省3例自安哥拉和赤道几内亚归国的三日疟患者血样进行检测.2例自安哥拉归来的患者分别于回国后15d和27 d发病；另1例患者曾在赤道几内亚发病,归国2个月后再次发病.3例患者均有发热、头痛和畏寒等症状,但发热规律不典型.2例患者出现总胆红素升高、脾大等临床表现.3例患者镜检均可见典型的三日疟原虫形态,巢式PCR检测均扩增出与三日疟预期一致的特异性条带,但CareStartTM疟疾快速诊断试剂盒检测结果均为阴性,3例患者均经复方青蒿素类药物(ACT)治愈.
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浙江省5例输入性疟疾误诊病例的病原学诊断分析
目的 对浙江省5例输人性疟疾误诊病例进行病原学诊断和鉴定. 方法 收集浙江省5例前期误诊为输入性间日疟患者的流行病学资料和血样,进行镜检、快速疟疾诊断试纸条检测和巢氏PCR检测(采用疟原虫属特异性引物和种特异性引物),并将PCR扩增片段测序后,与GenBank中已有的序列进行Blast比对分析. 结果 5例患者均为自非洲的归国人员,其中3例归国前有疟疾发病史.镜检结果显示,4份血样为卵形疟原虫感染,1份(病例1)为卵形疟原虫和间日疟原虫混合感染.快速疟疾诊断试纸条检测结果均为疟原虫阴性.巢氏PCR检测结果显示,5份血样的全血DNA均扩增出卵形疟原虫特异性条带(800 bp),其中1份血样(病例1)同时还扩增出间日疟原虫特异性条带(120 bp).测序序列经Blast比对,5份血样的扩增片段序列与卵形疟原虫SSU RNA部分序列的同源性均为99％,其中1份血样(病例1)的另一扩增片段序列与间日疟原虫SV5 18S rRNA部分序列的同源性为99％. 结论 5例输人性疟疾病例,4例为卵形疟原虫感染,1例为卵形疟原虫和间日疟原虫混合感染.
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乙型肝炎病毒X基因部分区段及其编码氨基酸变异的分析
目的 迸一步探讨X基因在乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)感染者疾病转归中的作用.方法 采用巢式PCR(nested-PCR),用型特异性引物对标本进行基因分型,针对基因分型成功的标本,采用巢氏PCR扩增X基因部分区段,对有特异性条带的扩增产物进行序列测定,测序结果用相关软件进行处理,翻译成蛋白质后与文献中已经公布的和疾病相关的变异位点进行比对并进行统计.结果 测序成功的41人份标本翻译成氨基酸后,与文献中已报道的与疾病相关的X蛋白变异位点进行比较,发现17个样品的变异与肝细胞癌相关,9例X基因中的插入和缺失变异,会导致X蛋白整个读码框架的改变.结论 本实验对HBV感染者的疾病转归进行了初步预测,通过追踪研究可对X基因在致病过程中所起的作用进行更为科学的调查和研究.
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人β-防御素-3与人表皮生长因子融合蛋白的克隆及原核表达
目的 克隆融合蛋白d-EGF成熟链基因,构建原核表达载体,并在大肠埃希菌(E.coli)表达体系中进行有效表达、分离纯化并鉴定其特异性.方法 以蛋白基因序列为基础,RT-PCR扩增人防御素-β和表皮生长因子基因,分别构建β-防御素-3(β-defensin-3)、EGF重组质粒,应用重组PCR方法,将EGF的DNA序列拼接到β-defensin-3 DNA序列的3′端,将基因克隆入原核表达载体pET-SUMO,构建重组质粒pET-SUMO-d-EGF.采用PCR、测序等方法鉴定后转化E.coli BL21 (DE3),经IPTG 诱导表达,Ni-trap柱纯化,SDS-PAGE 检测表达及纯化结果,后以Western blot对其进行特异性鉴定.结果 成功构建β-defensin-3、EGF重组质粒,经重组PCR成功扩增出294 bp的目的片段,重组体PCR结果与预期结果一致,测序正确.转入重组质粒的E.coli BL21(DE3)经IPTG诱导经SDS-PAGE分析得到28 kDa左右的目的蛋白条带.Western blot鉴定出融合蛋白含有抗EGF、β-防御素-3两种抗原特异性的蛋白.结论 成功构建原核表达载体pET-SUMO-d-EGF,并获得纯化的融合蛋白,为进一步的活性分析奠定了实验基础.
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龙岩市HBV感染者基因型分布特点及临床意义
目的 了解龙岩市HBV感染者基因型分布特点及临床资料的相关性.方法 采用巢氏PCR法对龙岩市240例HBV感染者进行基因分型.结果 240例HBV感染者中B型217例(90.4％),C型17例(7.1％),未分型6例(2.5％).B、C基因型在年龄、性别、不同临床诊断患者、HBeAg/HBeAb阳性率、HBV DNA载量水平的分布差异均无统计学意义.结论 龙岩市HBV感染者B型占优势.B、C基因型与HBV感染者的年龄、性别、HBeAg/HBeAb阳性率、HBV-DNA载量及疾病严重程度间均无相关性.
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犬源环孢子虫的形态学与分子鉴定
目的 对犬粪中的疑似环孢子虫卵囊进行形态学和分子鉴定.方法 对首次在犬粪中发现的疑似环孢子虫卵囊的形状、大小、抗酸染色、孢子化和自发荧光等形态特征进行了观察.根据GenBank已发表的环孢子虫序列设计并合成3条引物,对犬源环孢子虫18SrDNA部分序列进行巢氏PCR扩增,将扩增产物纯化并克隆至载体pMD19-T,挑选阳性克隆测序并进行同源性及系统进化分析.结果 该疑似环孢子虫卵囊与人的环孢子虫卵囊形态特征相似,扩增的18SrDNA片段大小为715bp,与预期目的片段一致.序列同源性和系统发育分析显示该犬源环孢子虫与环孢子虫间的相似性高,系统进化树中处于同一分支.结论 首次从犬粪中发现的疑似环孢子虫卵囊可以确定为环孢子虫.
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两种巢氏PCR方法检测二期梅毒血液标本的比较
目的 比较两种巢氏PCR方法在检测二期梅毒患者血液标本中的价值. 方法 针对tpp47和polA,分别建立两个巢氏PCR扩增全血中的梅毒螺旋体DNA. 结果 在353例梅毒阳性全血中,nPCR-tpp47和nPCR-polA分别检出142例(40.2％)和132例(37.4％),结果差异有统计学意义(X2=5.79,P＜0.05);两种巢氏PCR在血清学试验高滴度(RPR≥1:8或TPPA≥1:2 560)组的检出率明显高于低滴度组(RPR＜1:8或TPPA＜ 1:2560). 结论 在检测二期梅毒全血标本Tp DNA时,nPCR-tpp47优于nPCR-polA;巢氏PCR方法可作为梅毒血清学试验的补充试验.
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输入性三日疟原虫的实验室诊断
目的 分析输入性三日疟疾的实验室诊断,减少三日疟的误诊与漏诊. 方法 采用厚薄血膜涂片形态学检查、巢氏PCR对疟原虫18S rRNA基因进行扩增等方法确诊输入性三日疟疾病例. 结果 经过形态学和巢氏PCR检测发现首诊结果为未检出、检出未分型和诊断为恶性疟的7例患者感染三日疟原虫,有一例为间日疟原虫和三日疟原虫混合感染. 结论 在消除疟疾的地区,应当持续的进行疟原虫显微镜镜检技术的培训和分子生物学技术的推广应用,以满足现阶段输入性疟疾病例正确诊断和分型要求,尤其是罕见和少见虫种鉴定要求.
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巢式PCR在输入性三日疟实验室诊断中的效果评价
目的 评价疟疾参比实验室应用巢式PCR技术诊断输入性三日疟的效果.方法 采用巢式PCR对2015-2017年湖北省网报疟疾病例和疑似病例血标本进行疟原虫核酸检测,筛查三日疟阳性标本,并与疟疾快速诊断试剂盒(RDTs)检测结果、吉氏染色显微镜镜检诊断结果进行比较.结果 367例网报输入性疟疾病例中,经巢式PCR共检出15例(4.1％)三日疟病例.在这15例三日疟病例中,省级疟疾参比实验室镜检13例诊断为三日疟,1例为间日疟,1例为卵形疟;市级疾病预防控制中心镜检7例为三日疟,8例为间日疟;RDTs方法阳性6例;阴性9例.结论 在输入性三日疟的诊断和分型上,巢式PCR明显优于RDTs和镜检法,RDTs不能取代镜检对罕见疟疾进行诊断.
