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MTHFR 677 C/T基因检测室间调查品制备及其应用研究
目的 通过构建体外质粒DNA作为质控样本开展MTHFR677基因检测室间质量评价计划(简称室间质评),评估参评实验室检测能力及存在的问题,提高临床实验室MTHFR基因检测质量.方法 利用基因工程技术体外构建含有MTHFR677位点野生型(C)上下游序列的重组质粒,并采用定点突变技术得到该位点的突变型(T),分别作为野生型和突变型样本,两者等比例混合后作为杂合突变型样本,并制备质控样本盘开展室间质量评价.2016年和2017年室间质评计划为一年两次,样本盘包含5支样本,覆盖MTHFR 677位点各种基因型别.要求参评实验室收到样本后在规定时间内检测样本并网上上报位点基因型检测结果 .4次室间质评分别收到26份、28份、52份和56份有效汇报结果.依据回报结果计算各实验室成绩,使用Microsoft Excel软件进行统计分析,汇总各样本的总体符合率,并分析不同检测方法的符合率和检测错误类型.结果体外构建的重组质粒经Sanger测序验证分别含有MTHFR 677位点野生型(C)和突变型(T)序列,作为质控品在4次室间质评中并无出现检测失败的样本.2016年和2017年4次室间质评中成绩满分的实验室分别为96.15％(25/26),100％(28/28),96.15％(50/52)和98.21％(55/56).4次室间质评中,样本检测的总体符合率分别为99.23％(129/130),100％(140/140),96.92％(252/260)和98.93％(277/280).荧光分子杂交和芯片杂交法检测的样本符合率均为100％;荧光PCR法检测的样本符合率为97.5％(39/40),100％(45/45),94.29％(66/70)和100％(95/95);Sanger测序法样本符合率为100％(20/20),100％(15/15),90％(36/40)和92.5％(37/40).结论 本研究所制备的质控样本能够有效监测试剂检测性能,具有良好的适用性.各实验室在MTHFR 677基因位点检测总体准确率很高,但个别实验室检测能力有待提高.临床实验室的质量控制对于保证检测结果准确性具有十分重要的作用.
关键词： 亚甲基四氢叶酸还原酶 质粒 基因检测 质量控制 -
碳青霉烯类耐药的肠杆菌科细菌耐药机制研究
目的 探讨碳青霉烯类耐药肠杆菌科细菌(CRE)的耐药机制,建立获得性碳青霉烯酶流行监测体系.方法 收集华中科技大学同济医学院附属同济医院2007年1月至2010年6月临床分离非重复肠杆菌科细菌5604株,其中美罗培南抑菌环直径≤21 mm的肠杆菌科细菌100株.药物敏感性试验筛选出碳青霉烯类耐药菌株,采用聚合酶链反应(PCR)对碳青霉烯酶基因和基因附属结构进行分析；采用脉冲场凝胶电泳(PFGE)和Southern印迹杂交方法分析耐药菌质粒；采用多位点序列分型(MLST)方法对菌株进行分型及分析同源性；采用十二烷基磺酸钠-聚丙烯凝胶电泳(SDS-PAGE)方法对菌株的外膜孔道蛋白进行分析.结果 共检出CRE 11株,其中克雷伯菌属细菌7株.抗菌药物敏感性试验显示所有菌株对大多数抗菌药物耐药,低抑菌浓度美罗培南8～ 64 mg/L,亚胺培南4 ～ 64 mg/L,厄他培南4～64 mg/L,对氨基糖苷类和氟喹诺酮类抗菌药物的敏感性则变化较大.PCR检出 IMP-4阳性菌株6株,KPC-2阳性菌株3株,其中1株ST476型肺炎克雷伯菌同时携带blaIMP-4和blaKPC-2.对基因附属结构进行分析,结果显示blaKpC-2基因位于由Tn3转座子和Tn4401部分片段构成转座子上.PFGE显示大多数CRE含有3个或3个以上质粒.MLST分型发现2株肺炎克雷伯菌同属于ST476型.SDS-PAGE提示1株产酸克雷伯菌(Kox656)存在外膜孔道蛋白(OmpK35和OmpK36)双缺失.结论 本院CRE主要是肺炎克雷伯菌,产生碳青霉烯酶是细菌耐药的主要原因,IMP-4是其主要酶型.碳青霉烯酶基因的出现和传播对治疗和感染控制造成巨大威胁,应重视医院细菌耐药性特点及耐药菌感染的临床流行病学资料,从而为临床合理用药提供参考.
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抗菌药物浓度对整合子内耐药基因盒重组效率影响的研究
目的 研究在不同浓度链霉素下,aadA2基因盒在整合子attI位点的整合频率.方法将已知序列的1类整合子克隆到pACYC184质粒,该重组质粒命名为pACIDA;将该整合子上的整合酶基因克隆到pET28a质粒,该重组质粒命名为pETINT;这两重组质粒依次转化大肠杆菌BL21(DE3).转化后的大肠杆菌在加不同浓度的链霉素的LB液体培养基中,37℃过夜培养.使用荧光定量PCR技术分别测定aadA2基因盒在attI位点发生整合作用的整合子的拷贝数和总整合子的拷贝数,前者除以后者即可获得整合频率.结果高表达整合酶的情况下,在加入的链霉素浓度分别为0、20、30、40、50μg/ml时,aadA2基因盒在attI位点的整合频率依次为(1.97±0.24)×10-3、(3.23±1.77)×10-3、(3.27±0.67)×10-3、0.45±0.13、1.32±0.11.而在没有整合酶高表达的情况下背景频率低于(1.75±0.33)×10-7.结论高浓度的链霉素能够促进整合子中aadA2基因盒在整合子中attI位点的重组效率.
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绿脓假单胞菌超广谱β内酰胺酶基因型分布
目的检测绿脓假单胞菌(PA)超广谱β内酰胺酶(ESBLs)基因型分布.方法采集本院2001年3月～12月临床分离PA株,用三维试验法进行表型检测.对表型阳性菌株,用碱裂解法提取质粒,聚合酶链反应(PCR)方法检测质粒的酶基因型别,检测较常见的SHV、PER及OXA-2型,对阳性株进行测序.结果 126株中,43株产ESBLs(34.1%)表型阳性.耐药酶基因型分别为PER-1型有14株,占32.6%;未检出SHV和OXA-2型阳性株.结论我院产ESBLs的PA临床分离株耐药质粒携带的酶基因主要检出了PER型.
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肠杆菌科细菌质粒介导喹诺酮耐药基因qnr的研究
目的 调查武汉大学人民医院分离的肠杆菌科细菌中质粒介导喹诺酮类耐药基因qnrA、qnrB、qnrS基因的现状、基因型以及qnr基因阳性菌株所携带的广谱B内酰胺酶基因型.方法 PCR法对179株肠杆菌科细菌(129株大肠埃希菌、37株肺炎克雷伯菌和13株阴沟肠杆菌)进行qnrA、qnrB、qneS基因检测.KB纸片法检测对15种抗菌药的体外抗菌活性.琼脂平皿二倍稀释法检测阳性菌株对环丙沙星的MIC值.质粒接合试验分析qnrA、qnrB、qnrS基因的水平转移能力.对qnr阳性株,检测Ⅰ类整合酶基因及SHV-1、TEM-1、CTX-M、OXA-Ⅰ、OXA-Ⅱ、OXA-Ⅲ、DHA、EBC型β内酰胺酶基因.结果 179株肠杆菌科细菌中,共检测出含qnr基因阳性菌株25株(13.97%),包括6株(3.35%)含有qnrA基因,9株(5.02%)含有qnrB基因,10株(5.59%)含有qnrS基因.阳性株菌均对亚胺培南敏感且对多种抗生素耐药,其中2株qnrA阳性菌株和4株qnrB阳性菌株对喹诺酮类药物敏感.2株qnrA阳性菌株和4株qnrB及qnrS阳性菌株质粒接合成功.23株qnr阳性株Ⅰ类整合酶基因阳性,1株qnrB及qnrS阳性菌株Ⅰ类整合酶基因阴性,14株菌携带TEM-1型广谱β内酰胺酶基因、6株菌携带OXA-Ⅲ型广谱β内酰胺酶基因、7株菌携带EBC型AmpC酶.结论 湖北地区肠杆菌科细菌中存在qnrA、qnrB、qnrS基因的流行,qnr阳性菌株呈多重耐药,且喹诺酮类敏感菌株中有qnr基因的存在.qnr阳性菌株可携带多种广谱p内酰胺酶基因.
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肠杆菌科临床株质粒介导的喹诺酮类耐药机制的研究
目的 了解天津地区肠杆菌科临床株中质粒介导的喹诺酮类耐药基因qnrA、aac(6')-Ib-cr的分布并研究其耐药机制.方法 从天津地区8家三甲医院收集环丙沙星耐药(CPLX,MIC≥4μg/ml)的肠杆菌科菌株共116株,包括77株大肠埃希菌、24株阴沟肠杆菌、15株克雷伯菌属细菌.应用PCR方法筛查所有临床株的qnrA基因,并对大肠埃希菌进行aac(6')-Ib的检测;琼脂稀释法测菌株的药敏情况;DNA测序检测aac(6')-Ib-cr基因变异体;接合传递试验方法探讨细菌质粒介导的耐药性传递.结果 116株喹诺酮类耐药的肠杆菌科临床株中未发现qnrA基因阳性株;77株环丙沙星耐药的大肠埃希菌.15株检出aac(6')-Ib,其中对卡那霉素耐药10株、中敏4株、敏感1株;选出对卡那霉素耐药表型不同的6株菌的aac(6')-Ib扩增产物进行测序,结果表明5株菌在第223位(T→C或T→A)和454位(G→T)发生变异,均携带aac(6')-Ib-cr;6株测序菌株中4株接合传递成功,临床株对喹诺酮类和氨基糖甙类的耐药性部分传递给了受体株.结论 qnrA基因在天津地区116株肠杆菌科临床株中甚为罕见;首次在天津发现aac(6')-Ib-cr介导的喹诺酮类耐药.
关键词： 肠杆菌科 质粒 耐药 qnr基因 aac(6')-Ib-cr基因 -
肠杆菌科细菌中质粒介导的KPC-2型碳青霉烯酶的检测
目的 研究重症监护病房(ICU)出现的碳青霉烯耐药的黏质沙雷菌、肺炎克雷伯菌和大肠埃希菌等肠杆菌科细菌的分子流行病学及耐药机制.方法 2006年4月-2007年2月,从我院2个ICU病房分离到对碳青霉烯耐药或敏感性降低的21株黏质沙雷菌、10株肺炎克雷伯菌和1株大肠埃希菌.用脉冲场凝胶电泳(PFGE)和肠杆菌基因间重复性一致序列-PCR(ERIC-PCR)分析这些菌株的分子流行病学.用接合试验、质粒消除试验、质粒图谱分析、等电聚焦电泳(IEF)、特异性PCR扩增和序列分析以及外膜蛋白分析等技术研究细菌对碳青霉烯耐药的分子机制.结果 21株黏质沙雷菌为同一克隆株;10株肺炎克雷伯菌亲缘关系相近.亚胺培南和美罗培南对黏质沙雷菌、肺炎克雷伯菌和大肠埃希菌的MIC为2～8μg/ml,肺炎克雷伯菌K10为128和256μg/ml.所有菌株接合试验均获得成功,亚胺培南和美罗培南对接合子的MIC由原来的≤0.125μg/ml上升到1～2μg/ml.IEF、PCR扩增和序列分析证实黏质沙雷菌产KPC-2型碳青霉烯酶[等电点(p1)为6.7]和pI为6.5的β内酰胺酶;肺炎克雷伯菌产TEM-1(pI5.4)、KPC-2、CTX-M-14(p17.9)和pI为7.3的β内酰胺酶;大肠埃希菌产KPC-2、CTX-M-15(pI 9.0)和pI为7.3的B内酰胺酶;所有接合子均只产KPc-2一种β内酰胺酶.所有接合子质粒DNA的EcoR Ⅰ、Hind Ⅲ和Bcu Ⅰ限制性酶切图谱完全相同.外膜蛋白的十二烷基磺酸钠一聚丙烯酰胺电泳和基因序列分析发现肺炎克雷伯菌KIO由于OmpK36基因中存在插入序列ISEcp1而导致OmpK36膜孔蛋白的缺失.结论我院ICU病房出现大量碳青霉烯耐药的黏质沙雷菌、肺炎克雷伯菌和大肠埃希菌;KPC-2是引起这些细菌对碳青霉烯耐药或敏感性降低的主要原因;KPC-2合并膜孔蛋白缺失可导致肺炎克雷伯菌对碳青霉烯高水平耐药;同一种编码blaKPC-2的质粒在3种不同属的细菌之间传播.
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质粒介导的志贺菌产超广谱β内酰胺酶及其耐药基因型
目的 探讨产生超广谱β内酰胺酶(ESBLs)志贺菌的特性及与耐药质粒的关系.方法 用K-B法做药敏试验并筛选可疑产ESBLs志贺菌株;ESBLs表型确证试验检测可疑产ESBIs志贺菌;采用TEM、SHV、CTX-M-1组、CTX-M-2组、CTX-M-9组β内酰胺酶通用引物进行PCR检测,TEM、CTX-M-9组全编码基因引物进行PCR测定,对扩增产物进行DNA序列分析;对产ESBLs志贺菌进行接合传递试验,供体菌和接合子用稀释法进行MIC测定.结果 在275株志贺菌中有12株为产ESBLs志贺菌,其中8株志贺菌基因型为CTX-M-14型,4株为CTX-M-3型;产ESBLs志贺菌接合传递试验全部阳性,其接合子只对β内酰胺类抗生素耐药.结论 本地区志贺菌对β内酰胺类抗生素的严重交叉耐药是由ESBLs所致,产ESBLs志贺菌可通过质粒传递耐药性.
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大肠埃希菌中检出多种质粒介导的AmpC酶
目的 了解安徽省产质粒介导的AmpC β内酰胺酶细菌的基因型特征及耐药性.方法 收集临床分离无重复大肠埃希菌共407株,采用头孢西丁三维试验检测AmpC酶,琼脂稀释法检测耐药性,PCR扩增各组基因及测序以确定AmpC酶基因型.结果 头孢西丁三维试验阳性率为8.1%(33/407),其中质粒介导的AmpC β内酰胺酶的检出率为3.0%(12/407).PCR扩增和测序结果证实为5株blaCMY-2、4株blaDHA-1和2株blaACT-2基因,并发现1株新的CMY型基因,DNA测序表明该基因和CMY-2有97%的同源性,并在国内首次发现blaACT-2基因.药敏试验显示对头霉素和哌拉西林耐药,对亚胺培南100%敏感,2株产DHA-1型酶的菌株对头孢吡肟耐药.结论 安徽省各地区已有质粒介导AmpC酶的出现,基因型有CMY-2、DHA-1和ACT-2.碳青霉烯类药物可作为治疗产质粒介导的AmpC酶细菌感染的首选药物.
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单引物二次PCR法对重组质粒中HBV前C-C基因进行点突变的研究
目的 建立单引物二次PCR法对重组质粒中HBV前C-C基因进行4处点突变,并与传统环状突变法进行对比.方法 将变异点合成在一对互补引物中,先加入单条引物行PCR扩增,再以产物为模板,加入另一单条引物行PCR扩增.PCR产物加入Dpn Ⅰ酶,切除其中变异前的模板质粒,转化入大肠埃希菌DH5α,卡那霉素培养基筛选阳性菌落增菌测序.结果 对该质粒而言,采用单引物二次PCR法预期位点均发生变异,成功率高于传统环状突变法.4个变异后质粒与模板条带位置基本一致,4个质粒的拟变异位点均如预期变异成功,而其他氨基酸无变异.结论 单引物二次PCR法进行重组质粒基因突变较传统环状突变法成功率有所提高.
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发现一株产KPC-2型碳青霉烯酶肺炎克雷伯菌
目的 研究1株亚胺培南耐药肺炎克雷伯菌的耐药机理.方法 采用浓度梯度法 (Etest)测定细菌对各抗菌药物低抑菌浓度(MIC).通过等电点分析(IEF)、质粒抽提、接合试验、转化试验、聚合酶链反应(PCR)扩增及耐药基因克隆测序分析细菌编码的β内酰胺酶.结果 临床分离的肺炎克雷伯菌等电点显示3条β内酰胺酶条带,分别为5.4、6.7和8.2.PCR扩增测序临床分离菌含TEM-1(pI, 5.4)、SHV-12(pI, 8.2)和KPC-2(pI, 6.7)β内酰胺酶编码基因.转化菌只有一条β内酰胺酶条带,为6.7.从转化菌质粒(60 000 bp)上获得1 500 bp的克隆片段,测序证实其为KPC-2编码基因.结论 亚胺培南耐药肺炎克雷伯菌的质粒上携带水解碳青霉烯类抗生素的A类2f组KPC-2酶的编码基因.
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大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌质粒AmpC酶基因型及流行病学分析
目的 研究大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌中产质粒型AmpC酶株的比率、酶的基因型及其流行病学状况.方法 收集本院、福建省立医院两家医院2004年9月至2005年3月的67株耐头孢西丁不重复大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌,用酶提取物三维试验检测高产AmpG酶;抽提高产AmpC酶株质粒,用PCR及产物序列分析确定质粒AmpC酶和β内酰胺酶的基因型;质粒转化试验定位耐药基因;ERIC-PCR指纹图确定产酶株间的同源关系.结果 福州两家医院耐头孢西丁菌中产质粒型AmpC酶的发生率,大肠埃希菌分别为16.7%和10.5%,肺炎克雷伯菌则分别为8.0%和0.2株肺炎克雷伯菌产DHA-1型、4株大肠埃希菌产CMY-2型、1株大肠埃希菌产CMY-22型质粒AmpC酶;5株产CMY型AmpC酶的大肠埃希菌还分别同时产CTX-M-14、CTX-M-27、TEM-144和TEM-1型β内酰胺酶.7株菌中,1株肺炎克雷伯菌和3株大肠埃希菌可将头孢西丁耐药性转移给受体菌.7株产酶菌ERIC-PCR指纹图显示,2株肺炎克雷伯菌来自相同克隆,其余菌株来自不同克隆.结论 福州地区发现产DHA-1型AmpC酶肺炎克雷伯菌和产CMY-2型及CMY-22型AmpC酶大肠埃希菌.CMY-22型AmpC酶和TEM-144型β内酰胺酶是国内外首次报道,GenBank登录号为DQ256079和DQ256080.
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伤寒沙门菌耐药质粒pRST98spv毒力基因的研究
目的研究多重耐药伤寒沙门菌耐药质粒pRST98是否具有沙门菌属中其他致病菌毒力质粒上的高度保守基因--spv,并对扩增的spv基因进行克隆及核酸序列测定.方法对已确定能增强细菌毒力表型的耐药质粒pRST98,用spv基因特异引物进行PCR扩增和SPV探针的Southern blot分析,并将扩增到的spv基因片段装入克隆载体pGEM-T EASY进行测序.结果 PCR和Southern blot结果显示,伤寒沙门菌耐药质粒pRST98上亦存在spv基因的同源序列spvR和spvB,其ORF分别为894 bp和1 776 bp,与鼠伤寒沙门菌毒力质粒上spv基因的同源性超过99%.结论本研究从核酸水平首次证实伤寒沙门菌耐药质粒pRST98具有多效性,是既编码细菌抗药性又编码细菌毒力的"嵌合型"质粒.
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耐药铜绿假单胞菌携带的整合子及其耐药基因盒检测分析
整合子系统是铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa,PA)产生耐药的重要因素,其包括5'保守序列(CS,包括整合酶基因int、重组位点att Ⅰ和1个启动子)和3'CS(由qacE△1和sul1组成);整合子携带的耐药基因盒包括1个单独的基因和1个下游的重组位点attC;整合子通过att Ⅰ和attC位点之间或2个attC位点之间的重组而捕获耐药基因.本研究对临床分离的13株耐药PA菌行药物敏感试验后,对整合子和基因盒的携带情况进行检测,并对序列、定位及质粒接合试验进行分析.
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肺炎克雷伯菌质粒携带DHA-1型ampC基因的克隆和序列分析
我们观察到一些菌株对头孢西丁耐药,认为可能存在AmpC酶.在对一尿路感染病人尿标本中多重耐药肺炎克雷伯菌的质粒进行分析时发现了该菌质粒上携带的DHA-1型基因并对其进行了克隆和序列分析.
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产超广谱β内酰胺酶肺炎克雷伯菌中质粒头孢菌素基因型研究
肺炎克雷伯菌是医院内感染相关的常见细菌之一,对抗生素耐药主要原因是产生了各种β内酰胺酶.为了解我院肺炎克雷伯菌中β内酰胺酶编码基因存在情况,我们进行了相关基因的检测,现将结果报道如下.
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在33株产ESBLs的肠杆菌科临床株中鉴定1类整合子
抗生素耐药基因水平播散是多重耐药菌株在临床加剧的重要原因.整合子(Integron)是继质粒、转座子之后人类发现的又一种细菌耐药基因水平播散机制[1].产超广谱β内酰胺酶(ESBLs)是肠杆菌科临床株对β内酰胺类耐药的主要原因之一,本试验旨在研究1类整合子在我市产ESBLs肠杆菌科临床株中的分布.
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大肠埃希菌质粒介导CMY-2型AmpC酶基因的研究
目的 研究大肠埃希菌质粒介导的AmpC酶及其基因类型.方法 利用3-氨基苯酚硼酸对AmpC β内酰胺酶(AmpC酶)的抑制作用检测表型AmpC酶,琼脂稀释法测定细菌的MIC.通过接合试验分析质粒携带ampC基因的转移,用基因芯片技术和PCR测定ampC基因,将序列测定结果用EMBOSS软件进行分析,并用肠杆菌基因间重复序列(Enterbacterial repetitive intergenic consensus,ERIC)分型确定所分析菌株的分子来源.结果 对头孢西丁不敏感的74株临床分离大肠埃希菌中,AmpC酶阳性33株,基因芯片技术从8株菌及它们对应的8株接合子细菌中测出CIT组AmpC酶基因.用CMY型AmpC酶基因特异引物进行PCR可确定这些CIT组AmpC酶基因为CMY型.序列比较分析结果为CMY-2型ampC基因,GenBank登录号为DQ823449.抗菌药物对多数接合子细菌在接合前、后的MIC值相似,处于中介或耐药.然而亚胺培南对所有8株大肠埃希菌和它们的接合子细菌的MIC值为0.5或0.25 μg/ml.ERIC分型提示2株菌具有相同分子来源,其余6株菌的分子来源不同.结论 从北京解放军总医院患者送检标本分离的大肠埃希菌中发现质粒介导的CMY-2型AmpC酶.
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TEM型β内酰胺酶的特征及其研究进展
TEM型β内酰胺酶是目前世界上为流行且种类多的质粒编码丝氨酸蛋白酶,其中TEM-1是革兰阴性菌中常见的β内酰胺酶,约90%对青霉素耐药的大肠埃希菌都产生TEM-1[1].除肠杆菌科菌外,近年来TEM-10在葡萄牙的克吕沃尔菌属[2]、TEM-21在美国的绿脓假单胞菌[3]、TEM-52在韩国的宋内志贺菌[4]、TEM-52、TEM-63、TEM-131在韩国[5]和南非[6]的非伤寒沙门菌中也有报道.截止2006年1月30日,Bush和Jacoby在Lahey网站(http://www.lahy.org/studies/webt.htm)上已公布了150种TEM型β内酰胺酶,其中2000-2006年就发现了70多种.
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O139群霍乱弧菌Ⅰ类整合子结构分析
O139群霍乱弧菌是一种引起严重腹泻的肠道病原菌.随着对常用抗菌药物耐药的霍乱弧菌出现,研究其耐药机制和传播也变得重要.Ⅰ类整合子是细菌获得和传播耐药基因的重要机制,携带位点特异性的重组酶系统,可特异性识别耐药基因盒结构,并将其整合在其中,形成各种组合的多重耐药整合子,转移到细菌基因组其他位点上或通过质粒等在细菌之间扩散.本科在2005年分离的1株O139群霍乱弧菌NB05030中检出发现携带aadA2耐药基因盒的Ⅰ类整合子结构.
