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恶性疟原虫主要裂殖子表面蛋白1C末端19ku片段(MSP1-19)的表达及免疫效应检测
目的探讨恶性疟原虫主要裂殖子表面蛋白1 C末端19 ku片段(MSP1-19)重组蛋白的免疫活性. 方法利用毕赤酵母高效表达系统分泌表达MSP1-19,表达产物纯化后免疫新西兰兔,3次免疫后ELISA检测其血清中IgG滴度的变化,观测重组MSP1-19免疫效应. 结果 MSP1-19在毕赤酵母高效表达;重组MSP1-19免疫后,兔血清中IgG滴度的变化与对照组有显著差异. 结论 MSP1-19重组蛋白具有较好的免疫原性.
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吸血前后斯氏按蚊不同器官配子体激活因子的变化
目的 探讨斯氏按蚊头、唾液腺和卵巢中配子体激活因子的活性动态与按蚊吸血的相互关系.方法 应用体外雄配子体出丝观察方法检测雌性斯氏按蚊吸血前后唾液腺抽提物、头及卵巢匀浆上清中配子体激活因子对柏氏疟原虫雄配子体出丝诱导活性的动态变化.结果 吸血前后蚊头部匀浆上清的GAF活性为104.6%～122.1%,差异无显著性(P＞ 0.05);吸血后1 h内唾液腺抽提物和卵巢匀浆上清GAF活性分别降至41.4%和20.4%,吸血后第8 d唾液腺GAF活性恢复到吸血前水平;吸血后第2 d,卵巢的GAF活性急剧上升至96.0%,并持续到吸血后第8 d.结论 斯氏按蚊吸血前后唾液腺抽提物和卵巢匀浆上清中的配子体激活因子活性显著不同,其变化与蚊卵发育相关.
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套式PCR扩增SSU rDNA特定片段检测云南金平县疟原虫感染的研究
目的采用套式PCR系统诊断、鉴别人体疟原虫感染. 方法采用已建立的套式PCR系统扩增SSU rDNA特定片段检测云南金平县恶性疟镜检阳性患者的6份血样,并设阳性与阴性对照. 结果间日疟原虫、恶性疟原虫和三日疟原虫感染血样中分别扩增出104 bp、102 bp和115 bp预期大小的特定扩增带.正常人血、人源弓形虫、杜氏利什曼原虫DNA及灭菌双蒸水均未产生特异扩增带.6份血样中检出4份P.v.、P.f.和P.m.的混合感染,1份P.v.和P.f.及1份P.f.和P.m.的混合感染. 结论该系统特异、灵敏、稳定,在诊断疟疾的同时可准确地判定混合感染,对疟疾的诊断、大规模流行病学研究及疫情监控等具有实际应用价值.
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套式PCR扩增SSU rDNA特定片段检测云南金平县疟原虫感染的研究
目的采用套式PCR系统诊断、鉴别人体疟原虫感染. 方法采用已建立的套式PCR系统扩增SSU rDNA特定片段检测云南金平县恶性疟镜检阳性患者的6份血样,并设阳性与阴性对照. 结果间日疟原虫、恶性疟原虫和三日疟原虫感染血样中分别扩增出104 bp、102 bp和115 bp预期大小的特定扩增带.正常人血、人源弓形虫、杜氏利什曼原虫DNA及灭菌双蒸水均未产生特异扩增带.6份血样中检出4份P.v.、P.f.和P.m.的混合感染,1份P.v.和P.f.及1份P.f.和P.m.的混合感染. 结论该系统特异、灵敏、稳定,在诊断疟疾的同时可准确地判定混合感染,对疟疾的诊断、大规模流行病学研究及疫情监控等具有实际应用价值.
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套式PCR扩增SSU rDNA特定片段检测云南金平县疟原虫感染的研究
目的采用套式PCR系统诊断、鉴别人体疟原虫感染. 方法采用已建立的套式PCR系统扩增SSU rDNA特定片段检测云南金平县恶性疟镜检阳性患者的6份血样,并设阳性与阴性对照. 结果间日疟原虫、恶性疟原虫和三日疟原虫感染血样中分别扩增出104 bp、102 bp和115 bp预期大小的特定扩增带.正常人血、人源弓形虫、杜氏利什曼原虫DNA及灭菌双蒸水均未产生特异扩增带.6份血样中检出4份P.v.、P.f.和P.m.的混合感染,1份P.v.和P.f.及1份P.f.和P.m.的混合感染. 结论该系统特异、灵敏、稳定,在诊断疟疾的同时可准确地判定混合感染,对疟疾的诊断、大规模流行病学研究及疫情监控等具有实际应用价值.
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套式PCR扩增SSU rDNA特定片段检测云南金平县疟原虫感染的研究
目的采用套式PCR系统诊断、鉴别人体疟原虫感染. 方法采用已建立的套式PCR系统扩增SSU rDNA特定片段检测云南金平县恶性疟镜检阳性患者的6份血样,并设阳性与阴性对照. 结果间日疟原虫、恶性疟原虫和三日疟原虫感染血样中分别扩增出104 bp、102 bp和115 bp预期大小的特定扩增带.正常人血、人源弓形虫、杜氏利什曼原虫DNA及灭菌双蒸水均未产生特异扩增带.6份血样中检出4份P.v.、P.f.和P.m.的混合感染,1份P.v.和P.f.及1份P.f.和P.m.的混合感染. 结论该系统特异、灵敏、稳定,在诊断疟疾的同时可准确地判定混合感染,对疟疾的诊断、大规模流行病学研究及疫情监控等具有实际应用价值.
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恶性疟原虫重组乳酸脱氢酶胶体金免疫层析法检测试纸条的研制
目的 用氯金酸标记抗恶性疟原虫乳酸脱氢酶(LDH)单克隆抗体(McAb),研制用于诊断恶性疟原虫和间日疟原虫感染的胶体金免疫层析(GICA)试纸.方法 采用柠檬酸盐还原法制备胶体金颗粒、标记抗恶性疟原虫重组乳酸脱氢酶单克隆抗体,制成免疫层析检测试纸条.用该试纸条检测已知疟疾病人及健康人血样,鉴定方法的敏感性和特异性.结果 检测重组LDH抗原的小量为5 ng/ml;对30例恶性疟病人血样及40例间日疟病人血样进行检测,敏感性分别为83.33%和57.50%,检测100例健康者血样特异性为98.00%.结论 初步建立了同时诊断恶性疟原虫和间日疟原虫感染的GICA检测法.
关键词： 疟原虫 恶性 乳酸脱氢酶 单克隆抗体 胶体金免疫层析试纸技术 -
标准使用碳酸氢盐缓冲液进行恶性疟原虫培养和耐药性实验的研究
目的变化使用碳酸氢盐缓冲液以探讨药物对恶性疟原虫的不同效果. 方法用[3H]次黄嘌呤摄取法检测抗疟药物效果. 结果不同二氧化碳浓度引起的pH变化对氯喹抑制恶性疟原虫的效果差异显著,而乙胺嘧啶抑制恶性疟原虫的效果,受二氧化碳浓度的影响不大. 结论进行恶性疟原虫培养和耐药性实验时应根据二氧化碳的使用浓度而选择适当的碳酸氢钠浓度.
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恶性疟原虫HRP-Ⅲ基因的克隆及序列分析
目的克隆并测定恶性疟原虫海南(FCC1/HN)株HRP-I基因序列,比较FCC1/HN株与国外分离株HRP-I基因序列的差异.方法根据HRP-Ⅲ基因已知序列设计合成一对引物,应用PCR技术从FCC1/HN株基因组DNA中扩增HRP-I基因.通过定向克隆,构建真核表达重组质粒pcDNA3-HRP-I.阳性克隆的重组质粒经酶切及PCR鉴定后,用双脱氧链末端终止法进行基因序列测定.应用分子生物学软件进行不同分离株HRP-Ⅲ基因序列的同源性比较.结果 PCR扩增得到特异的FCC1/HN株HRP-I基因序列.酶切及PCR鉴定获得了正确的pcDNA3-HRP-Ⅲ重组质粒.测序表明,恶性疟原虫FCC1/HN株HRP-Ⅲ基因全长802 bp,包含一个内含子,编码224个氨基酸.序列分析表明,我国恶性疟原虫FCC1/HN株与国外的Itg2、FC27及IMTM22株HRP-Ⅲ基因序列有较高的同源性.结论成功克隆恶性疟原虫FCC1/HN株HRP-Ⅲ基因.序列测定及同源性分析表明,FCC1/HN株与其它分离株的HRP-Ⅲ基因序列有高度的同源性.
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广西间日疟原虫环子孢子蛋白基因型的初步研究
目的了解广西间日疟原虫种群的基因型组成及其地理分布. 方法用滤纸法采集经镜检确诊的间日疟原虫阳性病人血样31份, Chelex-100离子交换法用于提取滤纸血样中的DNA,改进的套式-等位特异-PCR和琼脂糖凝胶电泳用于鉴别性片段的扩增、分析和鉴定. 结果在19份广西当地间日疟病例血样中17份鉴定为温带族虫株(89.5%),2份为热带族虫株(10.5%);12份输入病例血样中,温带族8份(66.7%),热带型3份(25.0%),PV-2型1份(8.3%). 结论目前广西当地流行的间日疟以温带族虫株为主,少数热带族病例出现在环江和防城县;但输入间日疟病例中热带族虫株感染占较大比例.
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云南省恶性疟原虫抗萘酚喹株的体外培育
目的 培育恶性疟原虫萘酚喹抗性虫株,为恶性疟原虫抗性的深入研究提供实验虫株.方法 采用恶性疟原虫FccSM/YN株,用Trager法进行体外连续培养.待其正常生长后,在培养基中间断添加不同浓度的萘酚喹进行克隆筛选,培育抗性,在培育前及用药后不同时段同步化处理疟原虫,使疟原虫小环状体率达95%以上,然后用Rieckmann体外微量法测定萘酚喹对培养虫株的半数抑制浓度(IC_(50)).结果 药物刺激前(亲代)IC_(50)为3.03 nmol/L;药物刺激后166 d IC_(50)为43.07 nmol/L,为药物刺激前的14.22倍;停止药物刺激后25 d的IC_(50)为18.98 nmol/L,较药物刺激后166 d下降55.94%.但仍然较亲代高6.26倍.结论 连续体外培养药物间断刺激方法可以筛选培育出高度抗萘酚喹恶性疟原虫虫株.该株恶性疟原虫抗性不稳定,停药后抗性程度有所下降.
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应用巢式PCR对恶性疟原虫培养中支原体污染的检测
目的 应用巢式PCR检测恶性疟原虫体外培养中的支原体污染. 方法 根据支原体16s和23s保守序列设计PCR引物,应用巢式PCR检测恶性疟原虫体外培养中的支原体. 结果 体外培养的恶性疟原虫标本16份,PCR检测支原体均阳性,经测序比对后确认为口腔支原体.已知阴性对照无扩增带. 结论 应用巢式PCR能敏感和特异地检出恶性疟原虫体外培养中的支原体.
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间日疟原虫MSP1C端基因亚克隆及在肠埃希菌中的融合表达
目的在大肠埃希菌中融合表达间日疟原虫MSP1 C端编码基因,以获得能作为检测抗原的重组蛋白GST-PvMSP1 C. 方法以限制性内切酶BamHⅠ和SalⅠ双酶切质粒pMD/PvMSP1C,获得间日疟原虫MSP1 C端编码基因片段,柱纯化后,插入表达质粒载体的多克隆位点,构建重组体pGEX-4T-2/PvMSP1C,并转化大肠埃希菌BL21(DE3),阳性克隆以限制性酶切分析鉴定后,以IPTG进行诱导表达,表达产物以SDS-PAGE电泳与免疫印迹分析. 结果双酶切质粒pMD/PvMSP1C,获得1 119 bp的 PvMSP1 C编码基因片段,与预期片段大小相符;所构建的pGEX-4T-2/PvMSP1C重组体阳性克隆经双酶切鉴定与预期结果一致;SDS-PAGE电泳显示,GST-PvMSP1C融合表达蛋白的大小约63 ku,且能够分别被GST抗体与间日疟患者的血清所识别. 结论成功亚克隆并构建了间日疟原虫MSP1 C 端编码基因pGEX-4T-2/PvMSP1C表达质粒,诱导表达了GST-PvMSP1C融合蛋白,表达蛋白具有一定免疫活性.
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恶性疟原虫FCC1/HN株丙酮酸激酶基因的扩增、克隆和序列分析
目的扩增恶性疟原虫海南株FCC1/HN的丙酮酸激酶(PK)的编码基因,构建其原核和真核表达重组质粒,测定其序列,并了解它及它推导的蛋白质与恶性疟原虫3D7和人PK基因之间的差异. 方法根据3D7的PK基因设计合成一对引物,用PCR从FCC1/HN株基因组中扩增PK基因;将它分别定向克隆到原核表达质粒PGEX-4T-1和真核表达质粒pcDNA3,分别转化大肠杆菌JM109感受态细菌;经酶切、PCR扩增鉴定筛选到阳性重组克隆,用双脱氧链末端终止法测定其序列,用生物信息学软件分析PK序列及进行同源性比较. 结果 PCR扩增得到特异的FCC1/HN株PK基因,大小为2 235 bp,编码744个氨基酸.其氨基酸序列与3D7的同源性高达99.9%,与约氏疟原虫的同源性为70.2%,但与弓形虫和人的PK的同源性分别只有20.9%和21.6%～25.4%. 结论从FCC1/HN株基因组中获取了PK基因,成功构建了其原核和真核表达质粒,并测定了其序列;它与3D7的PK高度同源,但与人的PK基因同源性很低,可能是一个药物靶标.
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海南省间日疟原虫环子孢子蛋白基因分型及地理分布
目的确定海南省疟区间日疟原虫环子孢子蛋白(CSP)基因型及地理分布,为制定合理的防治对策提供科学依据.方法采用套式等位特异聚合酶链反应(PCR)技术,检测在海南省疟区内感染的间日疟病人滤纸血滴样本.结果在99份受检血样中,有54份显示约700 bp和约180 bp二条扩增带,为温带族虫株,占54.54%;33份显示约700bp扩增带,为热带族虫株,占33.33%;12份显示约700 bp和588 bp两条扩增带,为PV-2型虫株,占1 2.1 2%.结论海南省流行的间日疟原虫CSP呈多态性,且存在地理分布差异.
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NO在IL-12诱导抗伯氏疟原虫感染免疫效应中的作用
目的探讨NO在IL-12诱导抗伯氏疟原虫(P.b)感染免疫效应中的作用. 方法每只BALB/c小鼠接种5×105个感染P.b 的RBC,分组后分别给予5 mg/d NO合成酶选择性抑制aminoguanidine、0.03 μg/d IL-12和aminoguanidine联合IL-12 处理.观察各组小鼠原虫血症变化及生存时间.感染第5 d收集小鼠血清进行NO水平测定. 结果 aminoguanidine联合IL-12处理组小鼠的原虫血症水平与单独IL-12组差异不明显,却使小鼠生存率显著降低;IL-12联合aminoguanidine处理组较单独aminoguanidine及感染对照组原虫血症达峰值的时间显著推迟,小鼠存活时间明显延长.IL-12处理小鼠血清NO水平显著上升;给予aminoguanidine后的小鼠血清NO含量较低,与感染对照组水平接近. 结论 aminoguanidine能有效的抑制IL-12诱导的NO的产生,显著降低IL-12处理小鼠生存率,但对原虫血症水平无明显影响.因此,IL-12抗P.b感染的免疫保护作用部分依赖NO介导,且NO的作用可能并非是NO对疟原虫的直接杀伤.
关键词： 白细胞介素12 疟原虫 伯氏 NO合成酶选择性抑制剂 一氧化氮 -
云南省抗氯喹恶性疟原虫双氢青蒿素抗性株体外培育与单克隆品系的建立
目的 建立云南省恶性疟原虫抗双氢青蒿素的单克隆品系,为开展恶性疟原虫对青蒿素类的抗药性研究奠定基础. 方法 体外长期连续培养恶性疟原虫,采用体外间断双氢青蒿素药物刺激法对恶性疟原虫株进行抗药性培育,待达到一定抗药性后采用有限稀释法对虫株进行克隆,采用体外微量法测定克隆虫株对双氢青蒿素、青蒿素、氯喹的敏感性,并对其生物学特性进行鉴定. 结果 获得2个云南氯喹抗性恶性疟原虫对双氢青蒿素抗性的单克隆品系C10和H6,IC50值分别为39.01 nmol/L和26.91 nmol/L. 结论 经过8次体外间断药物刺激和筛选,获得2株恶性疟双氢青蒿素抗性单克隆品系,其药物耐受性水平与现场抗性株接近.
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3种PCR方法检测低密度恶性疟原虫血症的比较研究
目的 对多重PCR、巢式PCR、实时PCR检测结果进行比较,筛选适合低密度恶性疟原虫血症的检测方法.方法 实验室培养恶性疟原虫,同步化处理至环状体期占99％以上时涂制薄血膜,计数其原始密度.实验分3组,原虫血均按1∶40、1∶80、1∶160、……1∶40 960等11个梯度进行稀释,涂制厚血膜,并用显微镜检查确定低密度恶性疟原虫血症密度；再作倍比系列稀释,用3种PCR方法进行检测,确定各种检测方法的检测限,并进行比较. 结果 经显微镜检查确定配制的待测血样恶性疟原虫密度为21.92个/μl,多重PCR检测限为0.171 3个疟原虫/μl血,实时PCR为0.171 3个疟原虫/μl血,巢式PCR为0.085 6个疟原虫/μl血.检出率巢式PCR≥实时PCR＞多重PCR. 结论 3种PCR方法均可用于检测低密度恶性疟原虫血症.巢式PCR检出率和检测限均优于其他两种方法.
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约氏疟原虫感染早期CD4~+CD25~+Foxp3~+调节性T细胞的作用
目的 探讨调节性T细胞(Tregs)在致死型约氏疟原虫(Plasmodium yoelii 17XL,P.y17XL)感染早期的作用.方法 用P.y17XL感染DBA/2、BALB/c及BALB/c Treg消除小鼠,计数红细胞感染率;感染后第0、3和5 d制备脾细胞悬液,ELISA检测脾细胞培养上清中IFN-γ和IL-10水平.结果 P.y17XL感染DBA/2和BALB/c小鼠后,其感染结局分别为自愈和死亡.易感BALB/c小鼠于感染前1 d和感染后1 d经CD25单抗处理后,与正常感染小鼠相比原虫血症水平明显降低,生存率提高;脾细胞培养上清中IL-10水平于感染后第3～5 d显著降低,IFN-γ水平于感染后第3 d显著增高.结论 P.y17XL感染早期,BALB/c小鼠Tregs数量的过早升高影响宿主的易感性.Tregs可能通过分泌细胞因子IL-10抑制Th1型细胞免疫应答的有效建立.
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间日疟原虫顶端膜抗原1基因多态性分析
目的 研究不同地理株间日疟原虫(Pv)裂殖子顶端膜抗原1(AMA-1)基因多态性. 方法 采集镜检确诊的间日疟患者滤纸血 3滴,煮沸法提取滤纸血中pv DNA,套式PCR扩增包含PvAMA-1Ⅱ区(793 bp)DNA片段,扩增产物经电泳鉴定后纯化并测序,利用生物软件进行序列比对分析. 结果 17例患者感染的间日疟原虫分为9种单倍型,只有1种(V3)在基因库中未发现100％吻合的序列;含9个多态位点(s-9),核苷酸多样度(π)为0.00859±0.00093,非同义突变率1引同义突变率差值(dN-dS)为-0.00230±0.00539,但Z检验差异无统计学意义(P＞0.05).中性检验差异均无统计学意义(P＞0.05).重组事件的低数量(Rm)为2,在整个411 bp序列中R2随着核苷酸遗传距离增加呈下降趋势不明显. 结论 间日疟原虫顶端膜抗原1(AMA-1)Ⅱ区基因序列遗传多样性程度较低.
