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HIV-1转录调控机制的研究进展
HIV-1是一种人类的慢病毒,即可长期潜伏,又可迅速破坏其宿主.HIV-1复制的多变性可能是其独特的转录调节机制决定的.HIV-1基因的转录调节过程涉及到很多因素,包括细胞基本转录因子、病毒长末端重复序列指导的与转录效率有关的转录因子、Tat蛋白、HIV-1基因组5病毒长末端重复序列中的顺式作用元件和反应激活应答元序列,以及它们之间的相互作用.
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HIV Tat49-57增强人乳头瘤病毒16E7细胞毒性T细胞表位穿膜效应研究
目的探讨有穿膜序列HIV Tat49-57的人乳头瘤病毒(HPV)16E7限制性细胞毒性T细胞(CTL)表位融合肽的跨膜能力及其影响因素.方法在HPV16E7 HLA-A2+/H-2kb+限制性CTL表位E749-57的N末端连接穿膜肽HIV Tat49-57序列,应用固相技术合成此融合肽,用间接免疫荧光与激光共聚焦显微技术,研究其穿膜能力,用乳酸脱氢酶(LDH)释放法检测其体外诱导特异性CTL杀伤效应.结果穿膜序列HIV Tat49-57可以有效促进HPV16E749-57表位肽进人BHK细胞胞浆,并呈时间、剂量依赖关系(P＜0.05);与原表位肽相比,该融合肽有显著地激发特异性CTL活性的能力.结论在原CTL表位基础上引入穿膜序列,可以使其更快速、更有效地进入活细胞胞浆,为HPV16肽疫苗的设计提供一种新的思路.
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HIV-1Tat激活AKT信号增强肝细胞脂肪代谢基因表达
目的 研究人类免疫缺陷病毒1型(HIV-1)Tat蛋白在调节人肝细胞脂肪代谢基因表达中的作用.方法 根据人肝脏中调节脂质生成的转录因子固醇调节元件结合蛋白-1c(Serbp1c)和碳水化合物调节元件结合蛋白(ChREBP)及其下游基因(Dgat、Lpk、Fasn和Scd-1)的cDNA碱基序列,设计并合成引物;培养人肝细胞株LO2,PI3K/AKT信号通路抑制剂PD98059预处理,Tat蛋白刺激细胞后,提取不同时间点的细胞总RNA,逆转录生成cDNA,应用定量PCR(q-PCR)检测人肝细胞中Srebp1c和ChREBP及其下游基因Dgat、Lpk、Fasn和Scd-1 mRNA转录水平.结果 Tat蛋白显著增强人肝细胞中Srebp1c和ChREBP及其下游基因Dgat、Lpk、Fasn和Scd-1 mRNA表达水平,在刺激6h后达到峰值;PI3K/AKT信号通路抑制剂PD98059显著下调Tat诱导的Srebp1c和ChREBP及其下游基因Dgat、Lpk、Fasn和Scd-1基因转录.结论 HIV-1 Tat蛋白在人肝细胞中对脂质生成有促进作用,进而调节肝细胞脂肪代谢.
关键词： 人类免疫缺陷病毒1型 TAT 肝细胞 脂肪代谢 Akt信号通路 -
海马神经元中TAT-GluR6-9c-dansyl小肽的荧光观察
目的研究TAT-GluR6-9c-dansyl荧光小肽是否可以进入细胞内部.方法在培养的海马神经元中加入TAT-GluR6-9c-dansyl荧光小肽和对照肽TAT38-48-dansyl.结果用10 μmol/L TAT-GluR6-9c-dansyl处理的海马神经元在荧光显微镜下可以观到绿色荧光的出现,而对照肽TAT38-48-dansyl无荧光出现.结论 TAT-GluR6-9c-dansyl荧光小肽可以进入细胞.
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体内蛋白转导的研究进展
简要综述了几种能够携带药物跨越血脑屏障和细胞生物膜屏障的蛋白结构域的研究进展.
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TAT短肽修饰的聚乙烯亚胺-β-环糊精基因载体
目的:将HIV-1的转录反式激活蛋白(trans-activator of transcription protein,TAT)中的片段短肽(RKKRRQRRR)偶联于聚乙烯亚胺-β-环糊精(polyethylenimine-β-cyclodextrin,PEI-β-CyD)聚合物,构建出低毒性、高转染率的新型基因载体.方法:β-环糊精(β-CyD)和低分子量树枝状聚乙烯亚胺(PEI 600)通过羰基二咪唑(1,1'-carbonyldiimidazole,CDI)聚合形成骨架结构,通过琥珀酰亚胺-3-(2-嘧啶二硫)丙酸酯[N-succinimidy-3-(2-pyridyldithio) propionate,SPDP]将TAT短肽偶联于PEI-β-CyD,构成新的聚合物TAT-PEI-β-CyD.采用1H-NMR和FT-IR对聚合物进行化学结构表征;凝胶电泳阻滞实验、粒径测定和透射电镜观察TAT-PEI-β-CyD对DNA的浓缩能力,以及浓缩质粒DNA后颗粒形态和粒径大小;MTT法测定载体在A293和B16细胞上的毒性,并对A293和B16细胞进行体外细胞转染实验,以PEI 25 kDa作为对照.结果:1H-NMR和FT-IR结果显示,TAT短肽已成功偶联到PEI-β-CyD.凝胶电泳阻滞试验显示,TAT-PEI-β-CyD在N/P为4∶1时可以完全阻滞DNA的迁移.粒径测定结果和透射电镜图像表明,TAT-PEI-β-CyD/pDNA(N/P=30∶1)复合物粒径在100 nm左右.细胞毒性实验表明,在B16和A293两种不同细胞中,聚合物毒性低于PEI 25 kDa.体外转染结果表明,在N/P为30∶1时,聚合物在A293、B16和B16BL6细胞中的基因转染效率高;TAT短肽的偶联能提高PEI-β-CyD在B16、B16BL6细胞上的基因转染效率.结论:实验成功构建了TAT短肽修饰的PEI-β-CyD新型基因载体.该载体毒性低,基因转染效率高.
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人类免疫缺陷病毒储存库评估测定技术研究进展
HIV整合至CD4+T细胞、脾脏、淋巴结、胃肠相关淋巴组织中,成为HIV潜伏感染的储存库.学界提出“shock and kill”的治疗策略,即先激活释放再杀灭病毒.而实施该策略的前提是评估和测定HIV储存库的大小.本文介绍目前常用的测定HIV储存库方法如Alu-gag PCR、定量病毒产物分析及tat/rev诱导有限稀释法.Alu-gag PCR可区别整合与未整合病毒基因,但不能区分缺陷与有功能的前病毒,因此易高估储存库.定量病毒产物分析在纯化静止CD4+T细胞中进行,被誉为HIV储存库检测的“金标准”,但实验成本高,技术要求高,所需标本量大,仅由一轮激活并不能完全诱导产物释放,因此会低估储存库.Tat/rev诱导有限稀释法主要测定经由刺激物诱导表达多拼接RNA等生物学标志的潜伏感染细胞频数,具有所需血标本少,不用抽提病毒RNA,实验时间短,对于不同大小储存库都适用等优点,但可能高估潜伏储存库.
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Tat-LK15运载siRNA沉默RGC-5神经细胞nNOS基因的实验研究
目的：探讨离体条件下细胞穿透肽Tat-LK15运载小干扰RNA( small interference RNA,siRNA)沉默RGC-5视神经节细胞(retinal ganglion cell line, RGC-5)神经元型一氧化氮合酶( neuronal nitric oxide synthase, nNOS)基因的可行性,为在体条件下研究Tat-LK15运载siRNA沉默nNOS表达治疗神经病理性疼痛提供理论依据。方法①通过凝胶阻滞分析测定Tat-LK15与siRNA的佳交联比。流式细胞术检测Tat-LK15/ FAM-siRNA以佳交联比转染RGC-5细胞的转染效率；不同剂量 Tat-LK15(1、2．5、5、10和20μg )孵育RGC-5细胞24 h,流式细胞术检测细胞凋亡率。②制备nNOS高表达的RGC-5细胞模型。③将RGC-5细胞随机分为5组：对照组、模型组、Tat-S组( Tat-LK15运载nNOS/siR-NA转染模型细胞)、Lipo-S组( LipofectamineTM RNAiMAX运载nNOS/siRNA转染模型细胞)及 Tat-N组( Tat-LK15运载NCsiRNA转染模型细胞),通过Q-PCR及Western blot检测各组nNOS表达水平。结果 Tat-LK15与siRNA质量比为2∶1时可完全包裹siRNA,达到佳交联,此时其转染效率为(84．4±3．9)%。当 Tat-LK15剂量为20μg (6．1μmol · L-1)时才出现一定细胞毒性,细胞凋亡率高于对照组[(10．3±1．1)% vs (7．4±0．9)%,P <0．05]。造模后RGC-5细胞nNOS表达水平明显升高(P<0．05)。与模型组相比, Tat-S 组 nNOS mRNA 及蛋白表达水平降低( P <0．05),Tat-S组与Lipo-S组相比无差异(P>0．05)。结论Tat-LK15能高效转染siRNA,细胞毒性低,离体条件下可有效运载siRNA沉默nNOS的基因表达。
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TAT-tCNTF融合蛋白对Aβ_(25-35)诱导SH-SY5Y细胞损伤的保护作用
目的 确定TAT-tCNTF融合蛋白能够透过细胞膜进入细胞内,并研究其对Aβ诱导SH-SY5Y细胞损伤的保护作用.方法 重组PCR获得人截短型CNTF基因后,与pBV 220-TAT载体连接,在大肠杆菌中表达,细胞免疫荧光方法检测TAT蛋白运载融合蛋白穿过SH-SY5Y细胞膜的作用,Aβ_(25-35)诱导SH-SY5Y细胞产生神经毒性,采用MTT(四甲基偶氮唑盐)法检测融合蛋白对细胞存活率的影响,Heochst 33342/PI荧光双染法进行细胞凋亡和坏死的形态学观察,并进行LDH释放分析进一步检测TAT-tCNTF对细胞损伤后的保护作用.结果 成功构建pBV220-TAT-tCNTF表达载体,Western blot结果表明重组融合蛋白可以与CNTF抗体特异性结合,细胞免疫荧光方法显示TAT-tCNTF能大量进入细胞,而rhCNTF只有微量进入细胞.对Aβ_(25-35)诱导损伤的SH-SY5Y细胞MTT、Heochst 33342/PI荧光双染法及LDH分析都表明TAT-tCNTF能明显提高细胞的存活率.结论 TAT-tCNTF融合蛋白可以跨越细胞膜,能够保护Aβ_(25-35)诱导损伤的SH-SY5Y细胞,具有促进细胞生存生长的活性.
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HIV-1 HXB2株Tat半胱氨酸富集区N端移位突变体的构建及在大肠杆菌中的高效表达
目的 构建HIV-1 HXB2株Tat半胱氨酸富集区N端移位突变体,并在大肠杆菌E.coli B121(DE3)中进行高效表达和纯化.方法 应用PCR拼接的方法将首轮合成Tat基因的半胱氨酸富集区(64～111位核苷酸,22～37位氨基酸)移位至缺失半胱氨酸富集区的Tat(AC)的N末端,获得其突变体序列(Tat(CN)DNA),构建其原核表达质粒pET32a-Tat(CN),并转入大肠杆菌E.coli BL21(DE3)中进行诱导表达及纯化,经SDS-PAGE鉴定表达及纯化产物,纯化后的产物用间接ELISA进行鉴定.结果 构建了pET32a-Tat(cn)突变体,pET32a-Tat(CN)融合蛋白在大肠杆菌中表达水平为5.17 mg/nd,相对分子质量为31 ku.间接的ELISA结果表明,pET32a-Tat(CN)能与Tat兔抗血清呈特异反应.结论 成功构建了HIV-1 HXB2株Tat半胱氨酸富集区移位至TatN端的突变体,并能在大肠杆菌中高效表达,其纯化的蛋白pET32a-Tat(CN)很好地保留了与HIV-1 Tat兔抗血清的免疫反应性,为HIV-1 Tat的疫苗基础研究提供了一有价值的研究结论.
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对两种急诊生化检验结果回报时间的调查分析
目的 调查和分析基层医院在保证检测结果 准确可靠的基础上缩短完成急诊生化检测和回报检测结果 所需的时间.方法 采用1533例急诊生化标本,分为A组、B组两组,按两种检测方式进行检测,记录从血标本送实验室到检测报告发出所需时间.结果 A组(使用普通干燥管、美国贝克曼LX-20湿化学分析仪、医院检验信息系统(LJS)急诊生化检测TAT平均时间为104分钟,B组(使用促凝剂,分离胶真空采血管、美国强生Vitros350干化学分析仪、医院检验信息系统(LIS))急诊生化检测TAT平均时间为26分钟.结论 在各级医院使用促凝剂/分离胶真空采血管、专用的急诊干化学分析仪、医院检验信息系统(LIS)能够在30分钟内完成急诊生化检测并回报检测结果 ,值得临床上进一步推广.
关键词： 急诊生化检验检测结果回报时间 TAT -
注射TAT出现特大型过敏性紫癜1例
1病例报告
患者，男，38岁，因右肘部摔伤，于2010年9月1日4：30pm入我院治疗，在外科行清创缝合术后，遵医嘱于注射室注射TAT。询问无过敏史，采用新配制的TAT皮试液(浓度为150μ/ml)，在患者前臂掌侧下1/3处用0.1%新洁尔灭消毒局部皮肤待干后皮内注射0.1ml（含15μ）20min后观察结果，皮丘无改变，周围不红肿，无自觉症状，即将TAT余液加生理盐水至2ml肌肉注射。观察30min后，无不适反应离院，嘱不适随诊。五日后，患者感肌注及皮试部位肿胀，有蚁爬感，即到医院就诊。查体：臀部肌注部位可见10cm×11.5cm的不规则紫色斑疹，皮试部位见4cm×4.5cm圆形紫色斑疹，无其它不适。遵医嘱，非那根50mg肌注，1次／d，硫代硫酸钠0.64g、维生素C2.0g、加注射用水10ml缓漫静脉注射，1次／d，3d后症状消失。 -
凝血酶原片段(F1+2)及凝血酶-抗凝血酶(TAT)研究进展
随着血液生理、生化研究进展,凝血酶原片段(Prothrombin fragment 1+2,F1+2)与凝血酶-抗凝血酶(Thrombin-antithrombin,TAT)已从实验研究走向临床研究.目前常用ELISA方法检测F1+2及TAT含量,其敏感性及特异性均较好.二项指标的临床应用相得益彰,各有所长,对检测血栓前状态及DIC诊断较准确,可监测抗凝、溶栓疗效,在恶性血液病患者中含量均显著升高.
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破伤风抗毒素迟发过敏反应5例临床分析
2004年5月～2008年5月,我们对5例外伤患者注射破伤风抗毒素(TAT),均出现迟发过敏反应,给予积极治疗,效果满意.现报告如下.1 资料与方法1.1 临床资料本组5例,年龄20～40岁;3例为门诊患者,2例为住院患者;均需TAT注射.损伤原因:切割伤3例,锈钉刺伤1例,竹钉刺伤1例.损伤距TAT注射时间≤2 h 2例,≤4 h 1例,≤8 h 2例.相关病史:于1个月或几个月前注射过TAT者3例,过敏史不详者2例 .
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抗破伤风口服液治疗破伤风的疗效观察
自1998年2月至今,我们用协定处方抗破伤风口服液治疗破伤风,并与用破伤风抗毒素(TAT)治疗者比较.现将结果报告如下.临床资料:本文未发破伤风病者138例(A组),其中对注射TAT过敏者60例(治疗组),男38例、女22例,年龄12～75岁;对TAT注射不过敏者78例为对照组,男48、女30例,年龄10～68岁.
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酒精对破伤风抗毒素皮试结果判断的影响
目的 探讨酒精对破伤风抗毒素(TAT)皮试结果的影响.方法 抽取500例外伤后需注射TAT预防的患者,其中120例饮酒时间距TAT皮试时间＞12h,112例饮酒时间距TAT皮试时间＜12h,268例患者饮酒时间＞24h(24h内无饮酒史).每位患者均用同样的方法做TAT皮试,均在皮试后15～20min观察结果.结果 1组24h内无饮酒阳性率为20%,2组饮酒时间＞12h的阳性率33%,3组饮酒时间＜12h的阳性率63%.结论 TAT皮试距患者饮酒时间距离越近观察到的阳性率就越高,所以对于饮酒后需注射TAT的患者好在受伤后的24h内距饮酒时间越长越好,这样既可减少因酒精作用引起TAT皮试假阳性率,同时也能降低患者对酒精的敏感度.
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PreS-Tat真核表达载体的构建及表达
目的:构建pEGFP-PreS-Tat嵌合载体并在真核细胞中表达.方法:提取人乙型肝炎病毒并用PCR法扩增出PreS片段,定向克隆入pEGFP-C3载体,在PreS下游连接合成的Tat序列,构建成功的pEGFP-PreS-Tat质粒经脂质体转染Hela细胞,Western blot鉴定目的蛋白的表达.结果:酶切和测序结果表明成功地构建了pEGFP-PreSTat嵌合载体,Western Blot结果表明该载体能在Hela细胞中表达pEGFP-PreS-Tat融合蛋白.结论:成功构建pEG-FP-PreS-Tat载体并表达出相应的融合蛋白,为研究该融合蛋白的功能奠定了基础.
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TA-SOD融合蛋白表达载体的构建
目的:构建pET28a-TAT-SOD原核表达载体,纯化并测定其活性.方法:PCR法扩增TAT-SOD片段,插入载体pET28a后得到pET28a-TAT-SOD重组表达子,转化人肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导TAT-SOD融合蛋白表达.表达产物用SDS-PAGE电泳鉴定,组氨酸亲和层析柱纯化融合蛋白,利用SOD活性测定试剂盒测定其活性.结果:构建了高表达重组子pET28a-TAT-SOD,获得了相对分子质量约为25 000的具有活性的融合蛋白TAT-SOD,纯度达90%.纯化的蛋白浓度为700 mg/L,活性为197.54 U/L.结论:成功构建了具有活性TAT-SOD融合蛋白的表达载体.
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TAT-EGFP融合蛋白表达载体的构建及表达
目的:构建TAT-EGFP原核表达载体,在E.coli BL21中高效表达并纯化.方法:人工合成编码TAT蛋白转导区的DNA片段,插入载体pET28a后得到pET28a-TAT重组质粒,再连接绿色荧光蛋白(EGFP)基因,组成pET28a-TAT-EGFP重组表达子.转化大肠杆菌,IPTG诱导TAT-EGFP融合蛋白表达.表达产物用十二烷基硫钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)鉴定,组氨酸亲和层析柱纯化融合蛋白.结果及结论:成功地构建了TAT-EGFP融合蛋白的原核表达载体,在诱导后获得了高效表达并纯化,为进一步研究TAT的蛋白转导作用奠定了基础.
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体内蛋白传导及其在生物学上的应用前景
蛋白传导域PTDs是在蛋白传导过程中能高效穿过生物膜的结构域.其可以使所有细胞作为传导对象,而且具有相当高的传导效率,但其传导的机制尚不明了.目前所发现的高效的PTDs有Tat,VP22,ANTP.当它们形成嵌合蛋白,或与蛋白质、多肽、DNA等分子化学相连,用于化合物的体内传导时,无论对于生物学土的理论问题还是基因治疗中的实际应用都有重大的意义.
