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酶联免疫斑点技术的标准化研究
酶联免疫斑点技术因其灵敏度高,操作相对简便,广泛应用于疫苗的细胞免疫评价.本文对该方法的特点、标准化研究以及网络实验室的发展状况进行综述.
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应用T细胞酶联免疫斑点法诊断人类免疫缺陷病毒感染合并结核潜伏感染的实验研究
目的 探讨T细胞酶联免疫斑点法(TSPOT)在我国人类免疫缺陷病毒(HIV)感染人群中用于诊断结核潜伏感染的应用价值.方法 应用T SPOT-TB试剂盒对68例明确诊断的HIV感染者血液标本进行结核分枝杆菌(Mtb)特异性T细胞的检测,同时对所有病例做结核菌素纯蛋白生物(PPD)试验.结果 在HIV感染者总体、CD4＜200/μl和CD4＞200/μl各组中,T SPOT检测阳性率分别为67.65%、44.44%和70.69%,PPD试验阳性率分别为41.18%、11.11%和46.55%,其中在HIV感染者总体及CD4＞200/μl组中T SPOT检测阳性率均高于PPD试验,差异有统计学意义(P均＜0.005).T SPOT检测在CD4＜200/μl组中的阳性率低于CD4＞200/μl组,但差异无统计学意义(P＞0.05);PPD试验在CD4＜200/μl组中的阳性率远低于CD4＞200/μl组,差异有统计学意义(P＜0.05).结论 T SPOT检测在我国HIV感染合并结核潜伏感染的早期快速诊断中有较大应用价值,尤其是在CD4细胞计数＞200/μl的HIV感染人群中,阳性率高于目前常用的PPD试验.PPD试验阳性率受CD4细胞计数水平的显著影响,而T SPOT检测不受此因素影响.
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酶联免疫斑点测定的原理和技术要点
近年来随着免疫方法学的迅速进展,各种新的技术种类不断涌现.20世纪80年代初,国外科研工作者根据酶联免疫吸附试验(ELISA)的基本原理,建立了一种体外特异性抗原刺激淋巴细胞后,检测特异性抗体分泌细胞数量和功能的固相酶联免疫斑点技术(ELISPOT),后又将该技术发展为评估单细胞水平分泌特定细胞因子的功能和细胞数量[1～3].
关键词： 酶联免疫斑点技术 抗原特异性T淋巴细胞 细胞介导免疫应答 -
人类免疫缺陷病毒合并结核分枝杆菌感染者的抗结核细胞免疫功能
目的 评价HIV合并结核分枝杆菌潜伏感染或合并活动性结核患者的抗结核细胞免疫功能.方法 应用早期分泌性抗原靶蛋白(ESAT)-6和培养滤出蛋白(CFP)-10诱导的结核酶联免疫斑点法对云南地区100例明确诊断的HIV感染者的血液标本进行结核分枝杆菌特异性T淋巴细胞检测,同时应用流式细胞仪检测外周血CD3+CD4+T淋巴细胞和CD3+CD8+T淋巴细胞的绝对计数水平.采用Mann-Whitney检验进行非参数统计分析.结果临床上无活动性结核感染证据的HIV感染者中合并结核分枝杆菌潜伏感染的感染率高达67.6%.HIV合并结核分枝杆菌潜伏感染者的外周血CD3+CD4+T淋巴细胞(532×106/L)和CD3+CD8+T淋巴细胞(473×106/L)绝对计数与单纯HIV感染者(406×106/L和504 × 106/L)相比,差异无统计学意义.HIV合并活动性结核感染者的外周血CD3+CD4+T淋巴细胞绝对计数平均值为189 × 106/L,CD3+CD8+T淋巴细胞绝对计数平均值为293×106/L,均显著低于单纯HIV合并结核潜伏感染组和HIV组(U=168.0,U=163.0;U=147.0,U=374.0;均P<0.01).HIV合并活动性结核感染者的ESAT-6和CFP-10抗原特异性斑点形成细胞数(31/106细胞和82/106细胞)显著低于HIV合并结核分枝杆菌潜伏感染者(92/106细胞和109/106细胞.U=507.0,U=529.5,均P<0.01).结论 我国无活动性结核临床证据的HIV感染人群中有较高的结核潜伏感染率,HIV合并活动性结核感染者的总体细胞免疫应答功能及特异性抗结核免疫应答功能均严重受损.
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乙型肝炎病毒特异性细胞毒性T淋巴细胞应答与不同临床感染状态的关系
目的 分析人类白细胞抗原(HLA)-A0201限制性的特异性CTL,研究急性肝炎急性期和慢性乙型肝炎活动期患者T淋巴细胞对特异性抗原表位免疫应答的差异.方法 收集HLA-A0201阳性的5例急性肝炎急性期和6例慢性乙型肝炎活动期患者的外周血单个核细胞(PBMC),酶联免疫斑点技术(ELISPOT)测定针对HBV聚合酶区(Pol575-583)、包膜区(Env348-357)和核心区(Core18-27)3个CD8+T淋巴细胞表位肽特异性CTL的数量和功能.数据采用t检验.结果 经Pol575-583、Env348-357和Core18-27三条抗原肽刺激,急性乙型肝炎急性期患者组斑点形成细胞数(SFC)分别为110±13、165±17和185±20;慢性乙型肝炎活动期患者组SFC分别为22±4、23±5和30±5,两组差异有统计学意义(t值分别为10.9、15.2和8.0,均P<0.05).急性乙型肝炎急性期患者各抗原肽特异性CTL的应答能力Pol575-583
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人类免疫缺陷病毒1型特异性CD8+T细胞应答中人类白细胞抗原Ⅰ的限制位点
目的 了解HIV-1特异性CD8+T细胞应答及其相关的人类白细胞抗原Ⅰ型(HLA-Ⅰ)的限制位点.方法 以位于HIV-1 Gag、Vif、Nef区域的合成肽作为刺激表位,选择来自4例健康者的外周血单个核细胞(PBMC)建立4株EB病毒转化的B淋巴细胞样细胞系(BLCL),以此作为抗原递呈细胞(APC),对1例临床上长期不进展的HIV-1感染者CD8+T细胞的IFN-γ分泌细胞频率进行体外酶联免疫斑点技术(ELISPOT)测定和HLA-Ⅰ限制位点比对分析.结果 在特异性CD8+T细胞应答中HLA-Ⅰ分子能限制性递呈HIV-1表位,且呈现出高特异性;HLA-Ⅰ位点A03、A26、C04和C08限制性递呈HIV-1 Gag区域表位,A03和C08还限制性递呈Nef区域表位.结论 HIV-1 Gag区域表位的HLA-Ⅰ限制位点可能包括A03、A26、C04和C08,Nef区域表位的限制位点可能包括A03和C08.
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重型再生障碍性贫血患儿外周血及骨髓NKT细胞数量及功能变化
目的 探讨NKT细胞数量及其功能在重型再生障碍性贫血患儿外周血及骨髓中的变化.方法 采用流式细胞术检测10例重型再生障碍性贫血初治患儿及10例骨科对照儿童外周血及骨髓CD3+CD1d四聚体+NKT细胞水平.利用免疫磁珠法分离纯化iNKT细胞后,在NKT细胞的配体OCH+重组人白介素-2(rhIL-2)+重组粒系集落刺激因子(rhG-CSF)培养体系下进行扩增培养.测定在不同浓度OCH培养条件下,iNKT细胞的扩增倍数,并利用酶联免疫斑点技术测定iNKT细胞扩增活化后表达肿瘤坏死因子(IFN-γ)、白细胞介素(IL-4)的斑点形成细胞数.结果 再生障碍性贫血患儿外周血中CD3+CD1d四聚体+NKT百分率为(0.72±0.03)%,明显低于对照组的(0.92±0.02)%,骨髓中CD3+CD1d四聚体+NKT百分率为(0.82±0.02)%,明显低于对照组的(1.05±0.05)%,差异有统计学意义(P均=0.000).再生障碍性贫血患儿骨髓iNKT细胞体外扩增能力显著低于对照组;且中高浓度OCH条件下,iNKT细胞扩增倍数增高,生成IFN-γ降低,而生成IL-4增高,与低浓度条件下相比,差异有统计学意义(P均<0.01).结论 重型再生障碍性贫血患儿存在外周血及骨髓NKT细胞水平降低及功能异常;OCH能够促进iNKT细胞扩增,并可改善IL-4/IFN-γ的失衡,可能具有潜在的治疗价值.
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酶联免疫斑点技术和分枝杆菌改良罗氏固体培养法在肺结核辅助诊断中的价值
目的 评价酶联免疫斑点技术(ELISPOT)和分枝杆菌改良罗氏固体培养法在肺结核辅助诊断中的应用价值.方法 收集临床疑似肺结核的214例患者的血液和痰液,用ELISPOT技术(T-SPOT.TB试剂)分析血液标本中结核分枝杆菌特异性致敏T细胞的γ-干扰素释放情况;用酸性改良罗氏培养基进行痰液的分枝杆菌分离培养;用PNB固体培养法进行菌种初步鉴定,确定为结核复合群.比较两种方法在肺结核辅助诊断中的符合率和诊断效能.结果 两种方法的阳性检出率差异无统计学意义(x2=1.58,P=0.21),两法符合率为85.5％ (183/214).以临床确诊肺结核为金标准,固体培养法的敏感性为98.2％,特异性为100％,阳性预测值为100％,阴性预测值为98.1％,约登指数为0.98;T-SPOT.TB法敏感性为89.2％,特异性为83.5％,阳性预测值为85.3％,阴性预测值为87.8％,约登指数为0.73.结论 ELISPOT检测(T-SPOT.TB)对肺结核的诊断效能较好,检测周期较分枝杆菌固体培养方法短,在肺结核感染快速诊断和早期筛查中具有广泛应用前景.
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胸液中IFN-γ对结核性胸膜炎的诊断价值
目的：探讨利用酶联免疫斑点( Elispot)法检测胸水结核分枝杆菌特异性IFN-γ在诊断结核性胸膜炎的价值。方法对147例结核性胸膜炎患者(结核性胸膜炎组)、69例非结核性胸膜炎患者(对照组)胸水单个核细胞结核菌抗原特异性IFN-γ分泌水平进行检测，对比两者的检测差异。结果结核性胸膜炎组患者胸水IFN-γ水平显著高于对照组(P<0．001)。结论利用酶联免疫斑点技术检测胸液标本结核分枝杆菌特异性IFN-γ可用于结核性胸膜炎的诊断及鉴别诊断。
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结核分枝杆菌RD1区编码蛋白ELISPOT辅助诊断活动性结核病的应用价值
目的 比较E/C联合Rv3879c蛋白作为抗原的ELISPOT和T-SPOT.TB试剂盒,探讨其在活动性结核病诊断中的应用价值.方法 选取初治结核病患者106例作为结核组,43例肺部其它疾病患者做为疾病对照组和48例健康者做为健康对照组,应用T-SPOT.TB和ELISPOT检测受试者外周血单个核细胞的斑点形成细胞数量,同时对受试者行T研.结果 T-SPOT.TB和ELISPOT在结核病组中的敏感度分别为92.5％和93.4％,TST阴性对照组中的特异度均为91.5％,在健康者中的阳性率分别为18.8％和16.7％,且两种方法差异无统计学意义(均P＞0.05).结论 E/C联合Rv3879c蛋白作为抗原的ELISPOT能够诊断活动性结核病,并为结核感染诊断提供一定的依据.
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三种检测方法对结核性胸膜炎诊断价值的探讨
目的 探讨腺苷脱氨酶(ADA),结核蛋白芯片,结核分枝杆菌特异性酶联免疫斑点技术(ELISPOT)三种方法在结核性胸膜炎诊断中的应用价值.方法 对102例结核性胸膜炎患者的胸腔积液、血清和48例非结核性胸膜炎患者的胸腔积液、血清分别用ADA、结核蛋白芯片和结核分枝杆菌特异性ELISPOT三种方法进行检测.结果 胸液中的ADA、结核蛋白芯片和结核分枝杆菌特异性ELISPOT的灵敏性分别是84.3%、52.9%、97.1%,特异性分别是85.4%、89.6%、97.9%;血清中的ADA、结核蛋白芯片和结核分枝杆菌特异性ELISPOT的灵敏性分别是31.4%、74.5%、91.2%,特异性分别为75.0%、93.8%、95.8%.结论 胸水的ADA检测,血清的结核蛋白芯片检测,胸水与血清的结核分枝杆菌特异性ELISPOT检测对结核性胸膜炎有较高的灵敏性与特异性,对结核性胸膜炎有较高的临床诊断价值.
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T淋巴细胞斑点试验在结核性胸膜炎临床诊断研究
选择2014年8月~2015年8月收治的结核性胸腔积液患者与肿瘤性胸腔积液患者共80例，根据患者的病症类型分为结核性胸腔积液组及肿瘤性胸腔积液组各40例。应用Elispot技术检测两组患者血清和胸液中ESAT-6特异性T淋巴细胞，并根据检测结果进行诊断。将诊断结果与皮肤结核菌素试验的诊断结果进行对比分析，判断T-SPOT.TB诊断的灵敏度、特异度及准确度。血液样本及胸液样本的T-SPOT.TB诊断准确度均明显高于PPD的诊断准确度（P<0.05）；胸液样本的T-SPOT.TB诊断灵敏度明显高于血液样本（P<0.05）。 T淋巴细胞斑点试验在结核性胸膜炎临床诊断中具有较高的应用价值，且以胸水为样本准确性更高。
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酶联免疫斑点检测(T SPOT - TB)结核分枝杆菌与结核病的相关性分析
目的 研究酶联免疫斑点(T SPOT-TB)检测结核分枝杆菌特异性T细胞与结核病的相关性分析.方法 用酶联免疫斑点技术测定早期分泌性抗原靶ESAT-6和ESAT- 10特异性T细胞,由传染病研究所证实或可疑的72例病人作为实验时象,并将T SPOT- TB的测定结果和传统的诊断方法相比较.结果 64例肺结核或肺外结核病人中,T SPOT-TB方法检测到63例,表明其灵敏度为98,4％.其中的45例病人同时做结素实验,仅有40例呈阳性(89％),而T SPOT-TB测定100％为阳性(p＝0.056).72例病人中,有6人被排除活动性结核,其中5(83.3％)人T SPOT- TB实验阴性,因此可以在可疑活动性结核病人快速排除非结核病人.结论 T SPOT- TB实验对检测结核是一种灵敏的方法,对现在低发病率背景下检测结核的诊断程序及治疗监测是一种有用的补充.
关键词： 酶联免疫斑点技术 结核病 结核分枝杆菌特异性T细胞 -
酶联免疫斑点技术在淋巴结核病快速诊断中的临床应用
目的 探讨酶联免疫斑点技术(ELISPOT)在淋巴结核病快速诊断中的临床应用价值.方法 利用结核菌特异抗原EAST-6和CFP-10,通过ELISPOT技术,分别检测61例淋巴结核病患者、35例健康体检者和30例非结核淋巴结病患者外周血结核效应T淋巴细胞的数量,并与抗酸染色、PPD试验、结核抗体等方法进行比较.结果 61例淋巴结核病患者中,49例结核抗原特异ELISPOT阳性,35例健康体检者中,1例阳性,30例非结核淋巴结病患者中,仅1例阳性,提示该方法的敏感度、特异度分别为80.3％和96.7％.ELISPOT方法检测淋巴结核病患者的阳性率为80.3％,显著高于抗酸染色、PPD试验和结核抗体的检测.结论 ELISPOT技术是一种灵敏度高、特异性好的快速检测结核菌感染的方法,可用于淋巴结核病的快速诊断.
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酶联免疫斑点技术对小儿结核病的诊断价值
目的 探讨酶联免疫斑点技术(ELISPOT)对新疆地区小儿结核病的诊断价值.方法收集2006年10月-2007年12月新疆医科大学第一附属医院儿科2个月～14岁疑似结核病的115例患儿,采集外周静脉血,利用ELISPOT结核感染T细胞诊断试剂盒进行ELISPOT检测,同期行结核菌纯蛋白衍生物(PPD)试验,并进行全面临床评估,随访3～6个月,结合疗效进行终诊断.对ELISPOT检测结果与终确诊结果进行比较,计算其灵敏度、特异度,并与PPD试验作对比.分析不同年龄组(≤36个月龄及＞36个月龄)、有无并营养不良、是否为重症结核病、结核部位(肺结核或肺外结核)以及不同民族(维吾尔族、汉族)间ELISPOT检测与PPD试验阳性率的差异,及不同因素对ELISPOT试验和PPD试验结果的影响.结果ELISPOT诊断小儿结核病的灵敏度80%,特异度86%.ELISPOT试验阳性率显著高于PPD试验阳性率(P＜0.01).在结核病病例中,并营养不良组及重症结核病组PPD试验阳性率明显低于未并营养不良组及非重症结核病组(Pa＜0.05),而ELISPOT阳性率在各组间均无统计学差异(Pa＞0.05);＞36个月龄组与≤36个月龄组、维吾尔族组与汉族组、肺结核组与肺外结核组比较,无论ELISPOT试验还是PPD试验的阳性率均无统计学差异(Pa＞0.05).结论ELISPOT诊断小儿结核病敏感、快速,而且受营养不良、重症结核病因素的影响较小,对儿童结核病具有较高的诊断价值,可用于新疆地区小儿结核病的早期快速诊断.
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北京市昌平区某高校大学新生结核潜伏感染调查
目的 调查大学新生结核潜伏感染情况,以便采取预防性措施.方法 2010年10月随机纳入北京市昌平区某高校入学新生TST≥10 mm的健康受试者420例,应用ELISPOT检测经抗原刺激后分泌IFN-γ的效应T淋巴细胞(即斑点形成细胞,SFCs)数量,并对ELISPOT阳性者进行为期3年的结核感染发病情况监测.结果 ELISPOT检测LTBI总的阳性率为41.2％,在BCG接种(阳性率41.5％)和未接种(阳性率40.0％)中差异无统计学意义(x2=0.064,P=0.447),在rST直径10～14、15～19和≥20 mm组间(37.6％、45.4％和64.3％)差异有统计学意义(x2=8.408,P=0.015),173例未治疗的ELISPOT+/TST+者经3年的ATB监测,发病率为0.结论 北京市昌平区某高校大学新生LTBI比率高,但仅以ELISPOT和TST双阳性者为预防性治疗指标,尚不足够.
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结核γ-干扰素酶联免疫斑点检测在结核性心包积液诊断中的应用
目的 探讨结核菌特异性γ-干扰素(interferon-gamma,IFN-γ)酶联免疫斑点(enzyme-linked immunosorbent spot,ELISPOT)检测对结核性心包积液的诊断价值.方法 采用结核菌特异性IFN-γ ELISPOT技术同时检测20例结核性心包积液患者(TP组)和14例非结核性心包积液患者(Non-TP组)外周血单核细胞(peripheral blood mononuclear cells,PBMC)及心包积液单核细胞(pleural effusion mononuclear cells,PEMC)中结核菌特异性IFN-γ水平.结果 TP组PBMC和PEMC结核菌特异性IFN-γ水平均显著高于Non-TP组,差异有统计学意义(P＜0.01,P＜0.01).TP组心包积液中结核菌特异性IFN-y水平显著高于外周血IFN-γ水平,差异有统计学意义(P＜0.01,P＜0.01).PBMC ELISPOT检测结核性心包积液的敏感性和特异性分别为80.0％和85.7％;而PEMC ELISPOT敏感性和特异性为90.0％和85.7％.结论 结核菌特异性IFN-γELISPOT技术对结核性心包积液诊断和鉴别诊断具有很好的辅助价值.
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酶联免疫斑点技术在快速诊断结核性胸膜炎中的应用
目的 探讨酶联免疫斑点技术(enzyme-link immunospot assay,ELISPOT)在快速诊断结核性胸膜炎中的临床价值.方法 应用ELISPOT技术检测28例结核性胸膜炎患者、30例非结核患者对照者外周血单个核细胞的INF-γ,同时对24例病例和全部对照者行结核菌素皮肤实验(tuberculin skin test,TST).结果 病例组ESAT-6形成SFCs数为84(17.3,171.0)/2.5×105PBMCs,高于对照组的9(2.0,15.5)/2.5×105PBMCs,差异有统计学意义(P<0.001),病例组CFP-10形成的SFCs数为115.5(21.5,227.5)/2.5×105PBMCs,也高于对照组的7(2.0,16.5)/2.5×105PBMCs,差异有统计学意义(P<0.001).病例组TST硬结直径中位数为8.0 mm,对照组TST硬结直径中位数为4.8 mm,差异无统计学意义(P=0.099).ELISPOT灵敏度为85.7%,特异度为80.0%;TST灵敏度为70.8%,特异度为50.0%.胸腔积液抗酸杆菌检查的敏感度只有18.5%.ELISPOT特异度和阳性预测值高于TST,差异有统计学意义(P值分别为0.015和0.025);ELISPOT的敏感度和阴性预测值也高于TST,但差异无统计学意义(P值分别为0.19和0.25).ELISPOT和TST检测结果一致性较差(κ=0.26).结论 ELISPOT检测结核性胸膜炎具有较高的敏感度和特异度,可作为临床实践中快速诊断结核性胸膜炎的辅助诊断技术,使患者得到准确、及时的诊断和治疗.
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酶联免疫斑点检测技术的临床应用
酶联免疫斑点(enzyme-linked immunosorbent spot,ELISPOT) 检测技术结合了细胞培养技术与酶联免疫吸附(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)技术的长处,能够分析经特异抗原活化后分泌细胞因子[如干扰素-γ(interferon-gamma,IFN-γ)、肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor-alpha,TNF-α)等]的单个效应细胞的频数,具有敏感、特异、易于重复的优点[1],是检测抗原反应性效应细胞的可靠实验方法之一[2],目前已成为抗原特异性T细胞免疫学研究的主流技术.本文就ELISPOT技术作如下综述.
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酶联免疫斑点技术在肿瘤研究中的应用
酶联免疫斑点技术(enzyme-linked lmmunospot assav,ELISP0T)广泛应用在肿瘤疫苗开发、疗效评价和肿瘤病因研究方面,本文就ELISPOT技术的历史、原理、一般步骤、在肿瘤研究中的应用及优缺点做一综述.
