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乙肝表面抗原检测方法应用体会
乙型病毒性肝炎是指由乙肝病毒(HBV)引起的一种以肝脏炎性病变为主并可引起多器官损害的病,也是我国当前流行为广泛的一种传染病.乙肝血清标志物检测是人群初筛乙肝携带者以及血液制品乙肝病毒检测的关键步骤,目前我国常用的乙肝血清标志物常用的是乙肝表面抗原(HBsAg),本文就目前常用的几种血清学检测方法总结如下.1放射性免疫法(RIA)放射性免疫法[1]是一种较传统的乙肝表面抗原测定方法,是在抗原抗体特异性反应的基础上,利用同位素标记的与未标记的抗原,同抗体发生竞争性抑制反应的方法.RIA法的稳定性好,交叉反应少,特异性强,用血量少,但其缺点是影响因素较多,须严格按照说明书来操作,而且试剂具有放射性,易对环境和实验室造成污染,放射性标记物不稳定,有效期短,从而限制了其发展.
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胶体金法检测HBsAg存在的问题与对策
胶体金免疫层析测定(Gold immnnc chromatography,GICA,简称金标法),是近年来发展起来的一种新技术.从1989年金标法诞生至今,已广泛应用于免疫检测的各个领域.笔者主要是谈谈胶体金法检测HBsAg在平常工作中所存在的问题及对策.
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乙肝五项检测中易引起临床误诊的钩状效应
乙型肝炎病毒(HBV)感染的五项标志物(俗称两对半)的检测是乙肝患者必做的检验项目。医院检验科通过颜色深浅用肉眼或用酶标仪读数来得出结果，但这些结果并不一定总结表明患者病情的严重程度，甚至有时会导致临床医生误诊。1 在临床中可见到以下几种类型的检验结果 见表1。
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血清HBsAg和HBV DNA对慢性乙型肝炎肝组织病理状态的判别评价
目的：构建基于血清HBsAg水平、HBV DNA载量、HBsAg/HBV DNA比值判别慢性乙型肝炎肝组织不同病理学分级和分期的Fisher判别函数，评价Fisher判别函数判别肝组织不同病理学分级和分期的效能。方法472例经肝组织活检的慢性乙型肝炎患者入选本研究，其中HBeAg阳性279例，HBeAg阴性193例。血清HBsAg采用Abbott Architect I2000及其配套试剂检测，血清HBV DNA采用实时荧光定量PCR检测。统计分析采用SPSS 13.0软件。结果 HBeAg阳性患者血清HBsAg、HBV DNA与病理学分级和分期呈显著负相关（P＜0.05）；血清HBsAg/HBV DNA与病理学分级呈显著负相关（P＜0.01），与病理学分期无显著相关性（P＞0.05）。HBeAg阴性患者血清HBsAg与病理学分级和分期均无显著相关性（P＞0.05），血清HBV DNA、HBsAg/HBV DNA分别与病理学分级和分期呈显著正相关和负相关（P＜0.01）。根据Bayes 逐步判别分析，HBeAg阳性和阴性患者符合判别不同病理学分级的模型纳入自变量标准的指标分别只有血清HBsAg和HBsAg/HBV DNA，符合判别不同病理学分期的模型纳入自变量标准的指标分别有血清HBsAg、HBV DNA和HBV DNA。判别HBeAg阳性患者不同病理学分级的Fisher判别函数判别G1、G2、G3的一致率分别为5.8%、51.1%、59.1%，判别HBeAg阴性患者不同病理学分级的Fisher判别函数判别G1、G2、G3的一致率分别为95.5%、0.0%、5.7%；判别HBeAg阳性患者不同病理学分期的Fisher判别函数判别S1、S2、S3、S4的一致率分别为36.4%、34.9%、21.6%、57.9%，判别HBeAg阴性患者不同病理学分期的Fisher判别函数判别S1、S2、S3、S4的一致率分别为86.7%、29.4%、0.0%、0.0%。结论基于血清HBsAg和基于血清HBsAg、HBV DNA的Fisher判别函数分别对HBeAg阳性患者肝组织病理学分级G3和分期S4有重要的判别价值；基于HBsAg/HBV DNA比值和基于血清HBV DNA的Fisher判别函数对HBeAg阴性患者肝组织病理学分级G1和分期S1有重要的判别价值。
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慢性乙型肝炎病毒感染自然史中表面抗原水平的研究
目的 研究陕西地区慢性乙型肝炎病毒(HBV)感染自然史中乙型肝炎表面抗原(HbsAg)的变化情况.方法 153名患者分为免疫耐受期组(IT)、免疫清除期组(IC)、非/低水平复制期组(LR)、乙型肝炎e抗原(HbeAg)阴性肝炎组(ENH)、HBeAg阳性肝硬化组、HBeAg阴性肝硬化组.HBsAg滴度采用Abbott免疫化学发光检测仪(AXSYM)测定.分析每个阶段HBsAg滴度与HBVDNA、ALT的相关性.结果 慢性HBV感染不同阶段HBsAg滴度的中位数不同,分别为IT 131.67S/N,IC 91.43 S/N,LR 70.92 S/N,ENH 82.61 S/N,HBeAg阳性肝硬化组78.46 S/N,HBeAg阴性肝硬化组65.93 S/N.HBsAg滴度在IT组高,HBeAg阴性肝硬化组低.HBsAg滴度水平仅在IC组中与HBV DNA相关,不同阶段HBsAg滴度水平与ALT均无相关性.结论 在慢性HBV感染自然史不同阶段HBsAg水平有明显差异.但仅在Ic期HBsAg滴度水平与HBV DNA定量有相关性.HBsAg 滴度是否能作为慢性乙型肝炎治疗反应的预测因子尚需更多的纵向研究加以证实.
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血清HBeAg定量检测对慢性乙型肝炎患者核苷(酸)类似物治疗后e抗原血清转换的预测作用
目的 观察HBeAg阳性慢性乙型肝炎(CHB)患者核苷(酸)类似物抗病毒治疗后不同时期外周血HBeAg滴度的变化,并探讨其与HBeAg血清转换之间的关系.方法 对22例核苷(酸)类似物抗病毒治疗的HBeAg阳性CHB患者随访2年,分别于抗病毒治疗的基线、12周、24周、48周和96周收集患者的血清,化学发光法定量检测HBsAg、HBeAg水平;实时荧光定量聚合酶链反应(PCR)检测血清HBV DNA载量;同时全自动生化分析仪检测血清ALT水平.结果 抗病毒治疗2年后,7例患者发生HBeAg血清转换,15例患者HBeAg仍为阳性.两组在基线状态下HBV DNA、HBsAg和HBeAg定量无统计学差异(P>0.05).在治疗过程中,发生HBeAg血清转换的患者12周HBV DNA和12周、24周、48周HBeAg滴度的下降率均高于未转换的患者(P<0.05).12周达到HBV-DNA阴转的患者在后期仍有36.4%的概率不发生HBeAg的血清学转换.12周、24周和48周HBeAg水平小于0.976、1.059和0.369(log10 S/CO)以及12周HBeAg较基线下降大于45.3%、48周较基线下降大于82.1%,均可预测2年后e抗原的血清转换,ROC曲线下面积分别是0.833,0.859,0.962,0.872和0.910(P<0.05),敏感性均为83.3%,特异性分别为92.3%,92.3%,100%,92.3%和100%.结论 HBeAg阳性CHB患者核苷(酸)类似物抗病毒治疗后,血清HBeAg定量的快速下降,可作为预测后期HBeAg血清转换的良好指标.
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肝组织病变程度不同的慢性乙型肝炎患者血清HBsAg及HBV DNA水平比较
目的 分析慢性HBV感染者不同肝脏病变程度与HBsAg及HBV DNA水平的关系,探讨其临床意义.方法 316例慢性HBV感染者进入研究,含慢性乙型肝炎(CHB)119例,肝硬化(LC)99例,慢加急性肝衰竭(ACLF)98例.HBsAg定量采用罗氏电化学发光法,HBV DNA定量采用实时荧光定量PCR法检测.肝组织病理炎症(G)分为1～4级,纤维化程度(S)分为0-4期.比较CHB、LC和ACLF患者间以及肝组织病理炎症和纤维化程度不同的CHB患者间HBsAg和HBV DNA水平的差异.结果 CHB、LC和ACLF组患者组间HBsAg和HBV DNA的总体水平无明显统计学意义;G1、G2、G3和G4患者的HBsAg水平分别为(288.8±182.1)IU/ml、(264.8±175.6)IU/ml、(279.8±163.6)IU/ml和(317.8±150.0)IU/ml,HBV DNA水平分别为(5.0±2.1)log10 IU/ml、(6.1±1.7)log10 IU/ml、(5.6±1.8)log10 IU/ml和(5.8±1.7)log10 IU/ml;S0-1、S2、S3、S4患者HBsAg水平分别为(234.7±182.5)IU/ml、(261.2±175.6)IU/ml、(305.8±149.2)IU/ml和(320.8±157.4)IU/ml,HBV DNA水平分别为(5.5±2.1)log10 IU/ml、(6.2±1.9)log10 IU/ml、(6.0±1.5)log10 IU/ml和(5.3 ±1.8)log10 IU/ml,各组间无明显统计学意义.炎症和纤维化程度较明显的G3、G4以及S3、S4患者血清白蛋白水平明显低于其他患者.结论 慢性HBV感染者肝组织病变程度与HBsAg和HBVDNA水平无明显平行关系.
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监测HBsAg浓度对HBeAg阳性的慢性乙型肝炎患者恩替卡韦治疗反应的预测价值
目的 监测HBsAg浓度在恩替卡韦(ETV)治疗的HBeAg阳性的慢性乙型肝炎(CHB)患者血清中的动态变化,探讨其对治疗反应的预测价值.方法 回顾性研究.选择2011年1月至2013年7月在福建医科大学附属第一医院肝病中心住院及门诊接受ETV治疗(0.5 mg/d)的HBeAg阳性CHB患者26例,并进行1年的随访研究；于抗病毒治疗的0、3、6、9、12个月分别收集血清；化学发光法定量检测各时间点的HBsAg、HBeAg浓度；实时荧光PCR定量检测血清HBV DNA载量；速率法检测ALT含量；1年病毒学应答定义为抗病毒治疗1年后血清HBV DNA低于检测下限(500 IU/rnl)；统计学分析采用正态性检验、t检验、x2检验、相关性程度分析、绘制ROC曲线.结果 17例患者发生病毒学应答(VR+),9例未发生病毒学应答(VR-)；基线ALT水平VR+组](141.82±77.29) IU/ml]与VR-组[(134.20 ±49.76) IU/ml]无明显差别(t=0.27,P=0.793)；HBV DNA VR+组[(6.76±1.00) lg IU/ml]明显低于VR-组[(7.65±0.87) lg IU/ml](t=-2.27,P=0.033)；HBsAg浓度VR+组[(3.79 ±0.61) lg IU/ml]与VR-组[(4.19 ±0.43) lg IU/ml]无明显差别(t=-1.75,P=0.094)；HBsAg与HBV DNA水平呈正相关(r=0.45,P=0.02).HBsAg在治疗开始的前3个月下降较快,3个月后下降较缓慢.从基线到治疗3个月时,VR+组HBsAg平均下降(0.32±0.29) lg IU/ml,VR-组下降(0.14±0.10) lg IU/ml,差异具有统计学意义(t=2.245,P=0.035)；治疗3个月时lg HBsAg浓度的ROC曲线下面积大(AUC=0.840,P=0.022),临界值3.865 0 lg IU/ml的Youden指数大(0.602),其诊断敏感度为82.4％,特异度为77.8％ 结论 ETV治疗3个月时lg HBsAg≤3.865 0 IU/ml可作为预测ETV治疗1年病毒学应答的指标.
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低水平血清乙肝病毒表面抗原测定及其临床意义
目的了解低水平血清乙肝病毒表面抗原(HBsAg)的人群分布及其相关乙肝病毒血清标志物模式特征。方法微粒子酶免疫分析技术测定8?089例非肝炎病区住院患者血清HBsAg及其表面抗体(抗-HBs)、乙肝病毒e抗原及其e抗体(HBeAg、抗-HBe)和乙肝病毒核心抗体(抗-HBc)；根据定值参比血清和样本的HBsAg荧光速率值/阴性对照荧光速率值之比值 (S/N值)，并结合中和试验结果，确定浓度在5 μg/L以下的HBsAg阳性例数，并分析相关乙肝病毒(HBV)血清标志物模式。结果共检出HBsAg阳性816例，HBsAg浓度在5 μg/L以下的有189例，占总数的2.34%，占HBsAg阳性人群的23.16%。其中，HBsAg浓度在1 μg/L以下的有84例(44.40%)；1～2 μg/L的有33例(17.5%)；2～5 μg/L的有72例(38.10%)。对上述低水平HBsAg人群的5项HBV血清标志物检测获得8种模式，以“HBsAg、抗-HBc、抗-HBe阳性”，“HBeAg和抗-HBs阴性”模式为主(74.60%)；累计HBsAg和抗-HBc同时阳性者占94.17%；HBsAg与抗-HBs同时阳性只出现在HBsAg 1 μg/L以下人群中(6.45%)。结论低水平血清HBsAg人群不容忽视，提高HBsAg检测灵敏度有重要意义；同时检测相关HBV血清标志物，对于确定上述人群有帮助。
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时间分辨免疫荧光定量检测乙型肝炎病毒前S1抗原的研究
目的建立时间分辨免疫荧光定量分析乙型肝炎病毒PreS1抗原的方法.方法以基因重组的带有PreS1抗原的乙型肝炎表面抗原作标准品,应用双抗体夹心免疫荧光分析方法,用抗PreS1单克隆抗体和抗-HBs分别作为固相抗体和铕标记抗体,若样本中含有PreS1抗原,则形成抗体-抗原-铕标记抗体复合物,加增强液解离铕离子,采用时间分辨荧光测量技术,对乙型肝炎病毒PreS1抗原进行检测.结果自制TRFIA试剂检测PreS1抗原,单侧95%参考范围为0～0.26 ng/ml;自制TRFIA试剂与ELISA试剂对乙型肝炎患者血清标本中PreS1抗原的检测,TRFIA方法灵敏度高于ELISA方法,250份乙型肝炎患者血清标本中有3例标本ELISA方法结果为阴性,而用TRFIA方法可检测到PreS1抗原;对于弱阳性标本用ELISA方法检测不到时,TRFIA方法仍可检出.ELISA方法在一阳性标本1:4 096倍稀释时结果为阴性,而TRFIA方法在1:16 384倍稀释时仍为阳性;高、中、低三个浓度,批内和批间精密度测试变异系数(CV,%)均小于10%,平均回收率为103.3%;TRFIA方法检测PreS1抗原与HBsAg及HBeAg无交叉反应;50份我院正常体检者血清标本进行PreS1抗原的检测,结果均正常,特异性100%.结论 TRFIA方法定量检测PreS1抗原,灵敏度高,特异性强,能够准确及时敏感地反映患者体内乙型肝炎病毒的复制情况.
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HBV DNA PCR检测在HBsAg阴性献血人群中的应用
目的 探讨HBsAg阴性献血者HBV DNA榆测的应用价值,评估核酸检测的必要性.方法 采用PCR检测HBsAg阴性献血者HBV DNA.采用8人份混合血样测定,超离心浓缩病毒,磁珠法提取病毒核酸.如HBV DNA为阳性,则进一步检测乙型肝炎病毒血清标志物5项.结果 HBVDNA检测限量为25 U/ml,23 225份标本中有4份为HBV DNA阳性,检出率为0.17‰.进一步检测其他HBV感染的血清学指标,发现这4份标本中有2份为抗HBe和抗HBc阳性,1份为抗HBc阳性,1份为抗HBs、抗HBc阳性.对HBV DNA的定量测定表明,其含量在50～200 U/ml.结论 现行的2次酶联免疫技术的血液筛查存在HBV漏检,有必要在现有的血液筛查模式中增加抗HBc检测,或增加病毒核酸筛查.
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慢性HBV感染者低浓度HBsAg相关分子调查研究
目的 探讨低浓度HBsAg人群的分子生物学特征及流行病学意义.方法 采用PCR及基因测序的方法 对HBV慢性感染者136份低浓度HBsAg(低浓度HBsAg组)和44份高浓度HBsAg(高浓度HBsAg组)血清标本进行HBV DNA、酪氨酸-蛋氨酸-天冬氨酸-天冬氨酸(YMDD)变异检测,并分别对浓缩法HBV DNA105拷贝/L的47份低浓度HBsAg和37份高浓度HBsAg血清标本进行基因型检测,以及对直接法HBV DNA10~5拷贝/L的14份低浓度HBsAg和29份高浓度HBsAg血清标本进行S基因序列、血清型进行检测分析,S基因序列采用BioEdit软件与中国株参照序列进行比对.结果低浓度HBsAg组HBV DNA阳性率、YMDD变异率和HBV DNA对数值分别为34.6%(47/136)、0(0/136)和6.5±1.4,高浓度HBsAg组分别为84.1%(37/44)、9.1%(4/44)和8.9±1.8,两组之间差异有统计学意义(浓缩法χ~2=30.8,P<0.05;直接法χ~2=53.5,P<0.05;YMDD变异率精确概率法,P=0.003;HBV DNA对数值t=6.5,P<0.05);47例低浓度HBsAg病例中分别检出B基因型16例、C基因型5例、未分型26例,14例血清型分别为adw 7例、ayw4例、adr2例、ayr 1例,在两组人群中基因型的分布差异有统计学意义(χ~2=13.5,P<0.05),血清型的分布差异无统计学意义(χ~2=4.7,P>0.05),S基因测序结果未发现S基因变异,但6处16例次存在核苷酸碱基差异而氨基酸同义的多态性特征.结论 低浓度HBsAg人群HBV DNA存在低复制现象,基因型、血清型分别以B型、adw/ayw为主,S基因呈多态性特征,低浓度HBsAg存在可能与HBV S基因特殊的分子生物学特征使HBsAg表达低下有关,或与患者感染HBV后机体免疫系统的个体反应导致低浓度HBsAg诱导机体免疫耐受有关.
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乙型肝炎病毒S基因在毕赤酵母中的表达及在乙型肝炎病毒表面抗体检测中的应用
目的构建含有乙型肝炎病毒S基因的表达载体,在毕赤酵母中表达出高免疫反应性的重组乙型肝炎表面抗原(HBsAg)S蛋白,用以制备乙型肝炎表面抗体(HBsAb)酶免试剂盒.方法采用聚合酶链反应从含乙型肝炎病毒全基因序列(adw)的质粒PHBV1中扩增出S基因,并将其插入pPICZB质粒.携带有S片段的pPICZB质粒转化毕赤酵母菌株KM71H,甲醇诱导重组酵母细胞表达S蛋白.表达产物包被聚丙乙烯反应板,用酶联免疫吸附实验(ELISA)检测HBsAb. 结果酶切电泳及DNA测序证实乙型肝炎病毒S基因已正确克隆到表达载体中;聚丙烯酰胺凝胶电泳显示HBsAg在毕赤酵母中表达;表达量约占总蛋白的25%～35%.表达产物用ELISA测定效价达1∶25 600;Western blot显示与正常人血清无交叉反应;用纯化产物作为包被抗原对卫生部临床检验中心HBsAb质控物及血清标本进行检测,灵敏度达10 mIu/ml,特异性达100%,重复性及线性良好,与国产商品试剂检测结果一致. 结论毕赤酵母表达系统高效表达出具有良好免疫反应性和特异性的HBsAg,可用于基因工程原材料的HBsAb酶免试剂盒的研制.
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HBV标志物定量和标准化是临床检测的方向
HBV的抗病毒治疗目标是使HBeAg发生血清学转换和病毒复制的持续抑制.多项研究表明HBV的定量检测在决定治疗时机、减少治疗失败和监测耐药性方面发挥着重要作用.WHO建立了统一的标准品,以IU/ml(国内文献用U/ml)表示HBV DNA的含量.HBsAg和HBeAg在预测血清学转换中可能发挥着潜在作用.本文探讨了HBV病毒学和血清学标志物的监测及其在临床中的应用前景.
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HBsAg和HBV e抗原定量检测的临床意义
HBsAg和HBV e抗原(HBeAg)定量检测的发展有助于监测患者血中HBV抗原的动态变化,在干扰素治疗过程中优于单纯监测HBV DNA.长效干扰素治疗12和24周,HBsAg水平及其下降幅度与患者治疗结束及随访期间持续性病毒学应答甚至HBsAg转阴相关.HBsAg定量测定程序的标准化和HBeAg定量测定试剂的研发是亟待解决的技术问题,能够准确预测疗效和改变治疗方案的时间点和具体定量临界值也需进一步大样本临床研究来确定.
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常用乙型病毒性肝炎血清学标志物检测结果报告解释及临床应用
乙型病毒性肝炎(以下简称“乙肝”)血清学检测“两对半”标志物在临床实际检测应用中很常见,有定性和定量之分,前者用于患者乙型肝炎病毒感染状态的明确,后者则主要用于抗病毒药物治疗疗效预测和评估.定性测定中“两对半”标志物会出现一些不常见的模式,既让检验人员不知所措,也让临床医师感到困惑,直接影响检验结果的临床应用.本文探讨了临床实验室应当如何恰当地报告和解释常用乙肝病毒血清学标志物的临床检测结果,临床医师又应当如何正确地应用乙肝病毒血清学标志物,分析乙肝病毒感染者的状态,使乙肝“两对半”标志物检测能更好地应用于临床.
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一种国产HBsAg确认试剂的临床应用评价
目的 评价一种国产HBsAg确认试剂的临床应用价值.方法 对543份经HBsAgELISA初筛吸光度值/临界值(S/CO)10.7的血清标本,用国产HBsAg确认试剂盒进行确认,在双份待确定标本中分别加入特异性抗-HBs试剂和对照试剂,保温后按常规HBsAg ELISA法测定吸光压(A)值,按公式求得加抗-HBs孔的抑制率,如抑制率≥50%即表示该标本被确认为HBsAg阳性.对HBsAg弱阳性的标本进行"延长确认试验",即延长酶反应时间,以提高检测的灵敏度.随机挑选39份弱阳性标本用美国雅培公司Murex HBsAg确认试验进行比对.结果 对543份标本进行确认试验,其中504份初筛HBsAg阳性的标本中,被确认为阴性的有89份(17.7%),按初筛不同S/CO值分区的阴性份数/检测份数分别为:S/CO≤5.0有87/143(60.8%),5.0
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乙型肝炎表面抗原血清标准物质的研究
目的 研制国内用于HBsAg检测的血清标准物质.方法 用HBV血清学标志物、抗-HCV、抗-HIV均为阴性的献血员血浆,混合均匀,将HBsAg阳性血浆稀释至含量约40 IU/ml,然后进行真空冷冻干燥.检测方法采用电化学发光(ECLA)、化学发光免疫试验(CIA)和ELISA三种方法与国际标准(NIBSC编号:00/588)同时检测,将结果进行比对.结果 该标准物质定值为:(34.2±4.8)IU/ml.其稳定性实验表明室温(20～25 ℃,相对湿度20%～50%)可稳定4周;高温高湿度(37℃,相对湿度60%～80%)条件下,可稳定2周;在冰箱冷藏(2～8 ℃)保存,可稳定1年;-20 ℃可稳定1年以上.均一性检测结果:所采用的检测方法表明均匀性良好,无明显差异.结论 该制备物可以作为HBsAg免疫测定的血清标准物质.
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慢性乙型病毒性肝炎治疗现状和展望
HBV感染是导致肝硬化和肝癌的主要原因,在过去20余年里,慢性乙型肝炎的治疗药物主要为干扰素和核苷(酸)类似物两大类,它们虽然能有效抑制病毒复制,但仍面临HBsAg清除率极低,安全停药难等问题,难以实现"临床治愈(或功能性治愈)".新型的血清标志物的出现为指导临床如何安全停用抗病毒药物开辟了新的途径,同时,治疗慢性乙型肝炎的新型药物和生物制剂的崛起也给慢性乙型肝炎患者带来福音.
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影响HBV感染慢性化的宿主因素及其在乙型肝炎防治中的意义
肝炎病毒(Hepatitis B Virus,HBV)可引起急性和慢性的肝脏感染,急性感染可致大约0.5%的患者死于爆发性肝炎,而慢性感染中,约25%的患者会变成不可治愈的肝癌[1],全世界死于由HB V感染所引起的肝癌人数每年超过一百万[1,3].急性和慢性肝病的不同结局很大程度上是由于机体对HBV感染的免疫反应所致,这种应答可以导致肝细胞的大范围的损伤[4],丧失必要的清除感染能力.目前还不知道为什么这种应答不能清除病毒而使许多人成为慢性病毒的携带者.因此,HBV研究的一个主要焦点是阐明有哪些宿主因素决定了HBV感染是急性的还是慢性的,这将有助于更好的治疗和降低肝细胞癌的发生概率.
