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hDaxx基因转染抑制地塞米松诱导的巨噬细胞凋亡
利用真核表达载体pEGFP/hDaxx在巨噬细胞中高表达hDaxx,研究hDaxx对巨噬细胞凋亡的影响.将pEGFP/hDaxx转染巨噬细胞,Western blot鉴定Daxx的表达,荧光显微镜观察GFP-hDaxx融合蛋白在细胞内的表达及定位,用地塞米松诱导巨噬细胞凋亡,细胞用Giemsa染色后,观察细胞形态变化并计算巨噬细胞凋亡率.结果显示:GFP-hDaxx融合蛋白在巨噬细胞中成功表达并定位于细胞核,且GFP-hDaxx融合蛋白不影响Daxx的特异性;地塞米松对照组与pEGFP对照组凋亡率无显著性差异(P＞0.05),而pEGFP/hDaxx组凋亡率显著降低(P＜0.01),即hDaxx即时高表达降低地塞米松诱导的巨噬细胞凋亡率.Daxx为调控蛋白,GFP-hDaxx融合蛋白在巨噬细胞中表达并定位于细胞核,且hDaxx即时高表达可抑制地塞米松诱导的巨噬细胞凋亡.
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hDaxx即时高表达增强HBV X蛋白对HepG2凋亡的抑制作用
[目的]研究乙型肝炎病毒X蛋白(HBx)与hDaxx的相互作用及对HepG2细胞凋亡的影响.[方法]构建pGBKT7-hDaxx和pGADT7-HBx酵母表达载体,利用酵母双杂交系统检测HBx与hDaxx的相互作用.将HBV X基因转染HepG2细胞,建立稳定表达HBx的HepG2X细胞株;pcDNA3.1-hDaxx转染HepG2X,5-Fu诱导凋亡,流式细胞术检测凋亡.[结果]共转pG-BKT7-hDaxx和pGADT7-HBx酵母质粒的酵母菌能在SD/-Trp-Leu-His(三缺)和SD/-Trp-Leu-His-Ade(四缺)的平板上生长,且Western blot检测到hDaxx和HBx在同一株酵母菌中的表达;稳定转染HBV X基因的HepG2细胞组凋亡率明显低于HepG2细胞组(P<0.01);且转染pcD-NA3.1-hDaxx后,细胞凋亡率进一步降低,与pcDNA3.1-hDaxx没有剂量依赖关系.[结论] HBx与hDaxx在酵母细胞内存在相互作用:hDaxx的即时高表达可增强HBx对5-Fu诱导的HepG2凋亡作用,HBx可能通过与hDaxx相互作用而抑制HepG2凋亡.
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腺病毒E1B 55kD癌蛋白与hDaxx的相互作用
为了探讨腺病毒(adenovirus,Ad)E1B 55kD癌蛋白(Ad E1B 55kD)打破hDaxx和PML共定 位细胞核的作用机制,本文利用体内外共免疫沉淀反应研究Ad E1B 55kD与hDaxx的结合反应 ,并通过酵母双杂交体系测定两种蛋白质的相互作用及其作用的氨基酸残基序列.结果显示 :Ad2 E1B 55kD通过C端58个氨基酸(aa)与hDaxx结合并发生相互作用.Ad12 E1B 5 5kD与hDaxx结合需全序列aa及其构象.共免疫沉淀反应和Western blot结果证实Ad2/5或Ad1 2 E1B 55kD能在体内外与hDaxx直接结合.
关键词： 腺病毒E1B 55kD癌蛋白 hDaxx 酵母双杂交测定 相互作用 -
GST-hDaxx蛋白的构建及其原核表达产物的鉴定
目的构建GST-hDaxx蛋白并在原核细胞中诱导表达GST-hDaxx融合蛋白,并研究其与p53的结合能力.方法构建GST-hDaxx融合蛋白原核细胞表达载体pGEX-4T/hDaxx,在大肠杆菌(E.coli)中用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达.表达产物用亲和层析柱加以纯化后,Western blot鉴定表达产物与纯化物.通过共免疫沉淀反应与Western blot观察hDaxx与p53的结合反应.结果在原核细胞中成功表达了GST-hDaxx融合蛋白,hDaxx与p53可发生共免疫沉淀反应.结论 1.GST-hDaxx融合蛋白成功表达; 2.hDaxx和p53的相互结合提示它们可能与肿瘤的发生有关.
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hDaxx高表达抑制地塞米松诱导的HeLa细胞凋亡
目的利用真核表达载体pEGFP/hDaxx在HeLa细胞中高表达hDaxx,研究hDaxx对HeLa细胞凋亡的影响.方法将pEGFP/hDaxx转染HeLa细胞,Western-blotting鉴定GFP-hDaxx融合蛋白的表达,荧光显微镜观察GFP-hDaxx融合蛋白在细胞内的表达及定位,用地塞米松诱导HeLa细胞凋亡,细胞用Giemsa染色后,观察细胞形态变化并计算HeLa细胞凋亡率.结果GFP-hDaxx融合蛋白在HeLa细胞中成功表达并定位于细胞核.地塞米松对照组与pEGFP对照组凋亡率无显著性差异(P＞0.05),而pEGFP/hDaxx组凋亡率显著降低(P＜0.01),即hDaxx即时高表达降低地塞米松诱导的HeLa细胞凋亡率.结论Daxx为调控蛋白,GFP-hDaxx融合蛋白在HeLa细胞中表达并定位于细胞核,且hDaxx即时高表达抑制地塞米松诱导的HeLa细胞凋亡.
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hDaXX与12型腺病毒E1B55KD癌蛋白在体内外的结合反应
目的研究12型腺病毒(Adenovirus 12,Ad12)E1B 55KD癌蛋白(Ad12 E1B 55KD)打破hDaxx与急性早幼粒细胞性白血病蛋白(promyelocytic leukemia protem,PML)在细胞核共定位的机制.方法构建hDaxx原核细胞表达质粒pQE30/hDaxx,并在大肠杆菌(E.coli)BL21中诱导表达,用镍一氮基三乙酸(Ni-NTA)琼脂糖加以纯化.通过体内外共免疫沉淀反应,Western blot方法研究hDaxx与Ad12 E1B 55KD直接结合反应. 结果质粒pQE30/hDaxx在E.coli BL21中成功诱导表达了hDaxx,其N端有6个组氨酸分子附着(6His-hDaxx).Western blot结果显示hDaxx在体内外与Ad1 2 E1B 55KD发生直接结合反应.结论表达并获得纯化的6His-hDaxx,hDaxx能在体内外与Ad12 E1B55KD直接结合.
关键词： hDaxx Ad12 E1B 55KD癌蛋白 共免疫沉淀反应 -
腺病毒12型E1B55kD蛋白增强hDaxx转录抑制活性
目的研究腺病毒12型E1B 55kD蛋白(Ad12E1B)对hDaxx转录调控的影响作用.方法利用酵母双杂交法分析hDaxx与Ad12E1B的相互作用;共免疫沉淀试验和Western blotting测定两种蛋白质在细胞内外的结合反应;通过虫荧光素酶报道基因系统,分析hDaxx对其转录活性的影响.结果 hDaxx在细胞内外直接与Ad12E1B结合,并与全序列Ad12E1B发生相互作用;Ad12E1B显著增加hDaxx的转录抑制活性(P<0.01).结论 Ad12E1B与hDaxx相互作用并增强hDaxx的转录抑制活性.
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hDaxx融合蛋白高表达降低活化巨噬细胞分泌IL-1β
目的研究GFP-hDaxx融合蛋白(GFP-hDaxx)即时高表达对激活巨噬细胞分泌IL-1β的影响.方法将GFP-hDaxx真核细胞表达载体pEGFP/hDaxx转染巨噬细胞,利用Western blotting检测表达产物.通过hDaxx 在巨噬细胞内的即时高表达,测定LPS刺激巨噬细胞后0.5 h、4 h、12 h时,活化巨噬细胞分泌细胞因子IL-1β的含量.结果 pEGFP/hDaxx在巨噬细胞内成功表达GFP-hDaxx融合蛋白.GFP-hDaxx在巨噬细胞内的高表达,使LPS诱导活化的巨噬细胞分泌IL-1β量明显降低(在4 h及12 h时与对照组差异有显著性,P<0.001).结论 hDaxx即时高表达降低活化的巨噬细胞分泌IL-1β.
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GFP-hDaxx融合蛋白在真核细胞中的表达与鉴定
目的构建GFP-hDaxx融合蛋白真核表达载体pEGEGFP/hDaxx,并在HeLa细胞中表达,为进一步研究hDaxx在细胞凋亡、病毒感染中的作用提供实验基础.方法用T4DNA连接酶将hDaxx亚克隆入载体pEGFP,筛选阳性克隆.将质粒pEGFP/hDaxx转染HeLa细胞,Western-Blotting鉴定表达产物,荧光显微镜观察GFP-hDaxx融合蛋白在细胞内的定位.结果成功构建了GFP-hDaxx融合蛋白真核表达载体pEGFP/hDaxx,GFP-hDaxx融合蛋白成功表达并定位HeLa细胞核.结论GFP-hDaxx融合蛋白成功地在真核细胞表达并定位于细胞核.
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hDaxx及其删除突变体在真核细胞中的表达与鉴定
目的构建N端融合有Gal4DBD的hDaxx及6种删除突变体(△hDaxx)真核细胞表达质粒,并在HT1080细胞中表达.方法将hDaxx及△hDaxx cDNA酶切片段连接到载体pM1或pM2相应位点,构建真核细胞表达质粒pM/hDaxx或pM/△hDaxx.用SuperFectTM脂转染试剂将质粒转染HT1080细胞,细胞裂解液经SDS-PAGE及转硝酸纤维素膜后作Western blot.结果构建的pM/hDaxx及6种pM/△hDaxx能在HT1080细胞中高度表达hDaxx或△hDaxx.结论 N端融合有Gal4DBD的hDaxx及6种△hDaxx在真核细胞中成功表达.
关键词： hDaxx hDaxx删除突变体 真核细胞 表达 -
hDaxx及其删除突变体在原核细胞中的表达与鉴定
目的将人Daxx(human Daxx,hDaxx)及其6种删除突变体(△hDaxx)在原核细胞大肠杆菌BL21(E.coli)中表达,以便在体外探索hDaxx的生物学活性.方法用PCR方法从Hela细胞cDNAs文库中扩增全序列hDaxx cDNA,利用载体pQE3x构建了hDaxx及其△hDaxx质粒,通过异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导E.coli表达相应蛋白质,并将其纯化.结果 IPTG能诱导hDaxx及其△hDaxx在E.coli中表达,表达产物纯化率达85%以上.结论 hDaxx及其6种△hDaxx能在E.coli中表达.
关键词： hDaxx hDaxx删除突变体 原核细胞 表达 -
hDaxx与乙型肝炎病毒X蛋白的相互作用
目的 采用酵母双杂交法研究HBV X蛋白与hDaxx蛋白的相互作用,为探讨HBV X蛋白的致癌机制奠定实验基础.方法 构建pGBKT7～hDaxx和pGADT7-HBx重组质粒,分四组转化酵母AH109,A组为pGADT7和pGBKq7,B组为pGBKT7-hDaxx和pGADT7-HBx,C组为pGADT7-T和pGBKT7-Lam,D组为pGAD,17-T和pGBKT7-p53.将转化菌落接种于SD/-Trp-Leu(二缺)固体平板,长出克隆后再接种于SD/-Trp-Leu-His(三缺)和SD/-Trp-Leu-His-Ade(四缺)平板,30℃培养36～72 h.裂解酵母茵,提取蛋白,经SDS-PAGE、Eestem blot检测hDaxx和x蛋白在酵母中的表达.结果 仅有共转化pGBKT7-hDaxx和pGADT7-HBx的AH109可以在三缺及四缺平板上生长.Western blot检测到hDaxx和X蛋白均能在酵母中表达.结论 HBV X蛋白与hDaxx能在酵母细胞内发生相互作用.
