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nm23-H1在子宫颈原位癌及浸润癌中的表达
目的:探讨nm23-H1表达与宫颈鳞癌发展转移的关系.方法:采用免疫组织化学方法检测23例宫颈原位癌及55例浸润鳞癌中nm23-H1的表达情况.结果:原位癌nm23-H1阳性表达率高于浸润癌(P＜0.05).浸润癌中,nm23-H1阳性表达率随FIGO临床分期升高而有下降趋势,Ⅰ、Ⅱ期与Ⅲ期比较,差异显著(P＜0.05);有淋巴结转移者其原发灶阳性表达率明显低于无淋巴结转移者(P＜0.01);组织学分化程度高者阳性率高于分化程度低者(P＜0.05).结论:nm23-H1基因可抑制宫颈癌发展及淋巴结转移.
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nm23-H1蛋白表达在非小细胞肺癌淋巴结转移的意义
目的:探讨nm23-H1蛋白在非小细胞肺癌(NSCLC)中的表达及与淋巴结转移的关系.方法:应用免疫组织化学法检测60例非小细胞肺癌组织中nm23-H1基因蛋白的表达.结果:NSCLC无淋巴结转移组nm23-H1蛋白阳性表达率为82.76%(24/29),高于NSCLC伴有淋巴结转移组45.16%(14/31),两者差异有统计学意义(P<0.01).结论:NSCLC中nm23-H1蛋白低表达易发生淋巴结转移,检测nm23-H1蛋白可在一定程度上评估NSCLC的预后.
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PTEN及nm23-H1蛋白表达在非小细胞肺癌转移中的意义
背景与目的 PTEN及nm23-H1基因均被证实是肿瘤转移的抑制基因,目前大多数研究都停留在基础研究上,本研究通过检测PTEN及nm23-H1蛋白在非小细胞肺癌(NSCLC)中的表达,以探讨它们的临床意义及相互关系.方法 应用免疫组织化学法检测60例非小细胞肺癌组织中PTEN及nm23-H1基因蛋白的表达.结果 NSCLC无淋巴结转移组PTEN蛋白阳性表达率为79.31%,高于NSCLC伴有淋巴结转移组41.94%,两者差异有统计学意义(P<0.01);无淋巴结转移组nm23-H1蛋白阳性表达率为82.76%,高于NSCLC伴有淋巴结转移组45.16%,两者差异有统计学意义(P<0.01).PTEN和nm23-H1蛋白表达在NSCLC中一致性较好(Kappa=0.436 6,Z=3.390 5,P<0.01),两基因可能有协同作用.结论 PTEN及nm23-H1蛋白表达均与NSCLC的淋巴结转移有关,PTEN和nm23-H1蛋白均可作为预测肿瘤转移的重要指标,对两种蛋白进行免疫组织化学联合检测,可能更有利于肺癌预测淋巴结转移及预后.
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Nm23-H1核内定位对人肺腺癌A549细胞增殖的影响
背景与目的 现有研究发现Nm23-H1还存在胞核表达,而既往的研究都是以过表达或抑制胞浆Nm23-H1为研究手段,由于Nm23-H1本身缺乏核引导序列,其研究结果并不能真实反映或重复临床中Nm23-H1以胞核定位为主的实际生物学效应.因此,本研究通过构建带有核引导序列的Nm23-H1载体并转染A549细胞以探讨Nm23-H1从胞浆向胞核转位对肺癌细胞增殖的影响.方法 采用基因重组技术构建带核定位信号序列的pLentis-CMV-NME 1-IRES2-PURO慢病毒载体,酶切和测序鉴定正确后,稳定转染A549细胞后用West-ern blot和激光共聚焦检测Nm23-H1蛋白的定位和表达,用CCK-8法检测细胞的增殖,流式细胞术检测细胞周期变化.结果 成功构建了核内定向表达Nm23-H1的慢病毒载体.转染组在72 h、96 h和120 h时增殖率与空载体组相比均显著升高(P＜0.000,1).空载体组A549细胞在G0期/G1期所占比例为35.69％,高于转染组的28.28％(t=1.461,P=0.217);而转染组细胞在G2期/M期所占比例为58.7％,空载体组为31.30％(t=4.560,P=0.010).结论 Nm23-H1在人肺腺癌A549细胞的核内过表达使细胞主要分布在G2期/M期并促进了细胞的体外增殖.
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具有不同酶活性并可抵抗特异shRNA降解的nm23-H1真核表达载体的构建和表达
背景与目的已有的研究证明nm23-H1基因是一个重要的肿瘤转移抑制基因，但其抑制肿瘤转移的生化机理尚不完全清楚。Nm23-H1基因结构和功能异常与肿瘤的侵袭转移有密切关系。我们前期已构建了nm23-H1的短发夹RNA（short hairpin RNA, shRNA）载体以及可抵抗此shRNA降解的nm23-H1的cDNA的表达载体，在此基础上我们欲应用基因定点突变技术构建具有不同酶活性并能抵抗此shRNA降解的nm23-H1cDNA真核表达载体，并通过恢复实验验证其表达，为进一步研究肿瘤抑制基因nm23-H1的分子机制提供理论基础和实验依据。方法以pcDNA3.1(+)-shRNA-resistant-nm23-H1质粒为突变模板，应用重叠延伸PCR方法引入nm23-H1基因四个单点突变和一个联合位点突变，并将突变基因片段克隆到真核表达载体pcDNA3.1Hygro(+)。将突变质粒转染人肺腺癌细胞株A549/nm23-H1-shRNA（稳定沉默nm23-H1基因），利用Western blot技术验证不同突变体nm23-H1蛋白的表达。结果成功构建了shRNA抵抗的nm23-H1S44A、nm23-H1P96S、nm23-H1H118F、nm23-H1S120G、nm23-H1P96S-S120G五个突变型真核表达载体，经DNA序列分析突变的碱基序列与实验设计完全一致，经Western blot验证nm23-H1蛋白表达正常。结论成功构建了五个具有不同突变位点的shRNA抵抗的nm23-H1基因真核表达载体，并且突变蛋白质nm23-H1表达正常，同时也表明重叠延伸PCR技术是一种高效、便捷、经济的DNA定点突变方法。
关键词： nm23-H1 重叠延伸PCR 定点突变 Western blot -
稳定表达荧光素酶的nm23-H1表达缺失人肺腺癌细胞株的构建及其体内外活性检测
背景与目的 在实验动物存活条件下,通过活体成像技术能探测到标记有萤火虫荧光素酶( luc)基因的肿瘤细胞在体内的分布情况.本研究旨在稳定表达nm23-Hl shRNA的人肺腺癌细胞株A549中,建立能稳定表达萤火虫荧光素酶的发光细胞株A549/nm23-H1 -shRNA-luc,并检测其体内外发光情况,为下一步相关的体内实验提供实验材料.方法 通过浓度梯度法测定A549/nm23-H1-shRNA细胞的潮霉素佳筛选浓度,将带有萤火虫荧光素酶基因的PGL4.50质粒转入549/nm23-H 1-shRNA细胞中,利用潮霉素筛选单克隆细胞株A549/nm23-H 1-shRNA-luc,并采用生物发光技术对单克隆细胞株进行阳性鉴定并挑选发光强的1个克隆分析其表达荧光素酶的稳定性.为检测A549/nm23-H1 -shRNA-luc细胞在体内发光的稳定性,将A549/nm23-H 1-shRNA-luc细胞接种于10只裸鼠右后腹股沟皮下之后,并随机分为两组,每组5只裸鼠,运用活体成像系统观察成像情况.结果 A549/nm23-H 1-shRNA-luc细胞的潮霉素佳筛选浓度为300 μg/mL.经过潮霉素筛选所建立的A549/nm23-H1 -shRNA-luc细胞株能在体外稳定表达荧光素酶,细胞数(x)和生物发光值(y)呈直线相关,回归方程是:y=3,699.9x+992,237,R2=0.975,l.为评估此细胞株在体内生物发光的稳定性,将细胞种植进入10只裸鼠并随机分成两组,结果显示体内生物发光值差异不具有统计学意义(P＞0.05).结论 成功建立了能持续、稳定表达荧光素酶的A549/nm23-H1-shRNA-luc细胞株.
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突变型nm23-H1基因的磷酸化活性研究
背景与目的 磷酸化活性是nm23-H1重要的生物学活性,本研究旨在探讨不同位点的突变对nm23-H1磷酸化活性的影响.方法 以野生型nm23-H1研究对照,采用放射自显影的方法检测nm23-H1野生型(WT)和4种突变型(P96S,H118F,S120G和S44A)原核表达蛋白的自身丝氨酸与自身组氨酸磷酸化活性,应用反相高效液相色谱技术(RP-HPLC)检测上述蛋白的NDPK激酶活性.结果 野生型和突变型nm23-H1蛋白的自身丝氨酸与自身组氨酸磷酸化活性由大到小依次为P96S、WT、S44A、S120G和H118F,而NDPK活性由大到小依次为:WT、S120G、P96S、S44A和H118F;经线性相关分析,自身丝氨酸与组氨酸磷酸化活性呈正相关(r=0.983,P<0.01),但NDPK活性与自身丝氨酸和自身组氨酸活性均无相关性(分别为r=0.458,P>0.05;r=0.482,P>0.05).结论 不同位点的突变对nm23-H1自身丝氨酸、自身组氨酸及NDPK激酶活性影响不同,NDPK活性与自身磷酸化活性并不完全关联.其中118位组氨酸是nm23-H1激酶活性的关键氨基酸;96位脯氨酸可能与nm23-H1的磷酸转移能力有关;而120位丝氨酸可能为自身丝氨酸和组氨酸磷酸化位点;44位丝氨酸可能为另一具有NDPK激酶的氨基酸.
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转移抑制基因nm23-H1参与肺癌Ras信号传导机理研究
背景与目的 nm23-H1基因已被证实为一种肿瘤转移抑制基因,但其作用机理尚不明了,本研究探讨nm23-H1参与肺癌Ras信号传导的机理.方法 应用脂质体法将pEGFP-nm23-H1野生型和突变型质粒(WT,H118F.S120G,P96S,S44A)转染人大细胞肺癌细胞株L9981,采用免疫共沉淀与Western blot方法检测野生型和突变型nm23-H1蛋白与Ras支架蛋白KSR的关系.结果 在转染了野生型和突变型质粒的五个细胞株中,鼠抗nm23-H1免疫沉淀物在86KDa处可检测到KSR的阳性条带,而各组KSR的量应用单因素方差分析比较无显著性差异(F=0.190,P=0.938).结论 本研究结果表明nm23-H1与KSR存在相互作用,但这种相互作用与nm23-H1有无突变及突变位点无关,nm23-H1可能是通过KSR参与肺癌Ras信号传导的.
关键词： nm23-H1 KSR 肺肿瘤Ras信号传导 -
nm23-H1基因转染对人高转移大细胞肺癌细胞株生物学行为的影响及作用机理
背景与目的 nm23-H1基因已被证明是一个肿瘤转移抑制基因,但其相关作用机理仍不明确.本研究通过比较nm23-H1基因转染前后人高转移大细胞肺癌细胞株L9981生物学行为的变化,探讨nm23-H1基因影响人高转移大细胞肺癌细胞株生物学行为的可能机理.方法 应用细胞体外增殖活性检测(MTT法)和体外侵袭力检测(改良Boyden小室法)技术分别检测nm23-H1基因转染前后人高转移大细胞肺癌细胞株L9981、L9981-pLXSN和L9981-nm23-H1肺癌细胞株体外增殖活性和侵袭力的变化;同时加入PKC特异抑制剂Calphostin C作用后,再次观察三株细胞株抑制剂作用前后细胞侵袭力、增殖力的变化.结果 nm23-H1基因缺失的人高转移大细胞肺癌细胞株L9981和L9981-pLXSN体外侵袭力和增殖活性明显高于转染nm23-H1基因的L9981-nm23-H1肺癌细胞株(P<0.001);L9981和L9981-pLXSN细胞间体外侵袭力和增殖活性则无统计学差异(P>0.05).用PKC抑制剂Calphostin C处理L9981、L9981-pLXSN和L9981-nm23-H1肺癌细胞株后,细胞体外侵袭力和增殖活性下降(P<0.001),而转染nm23-H1基因的L9981-nm23-H1细胞体外侵袭力和增殖活性仍低于L9981和L9981-pLXSN(P<0.001),L9981和L9981-pLXSN细胞间则无统计学差异(P>0.05).结论 nm23-H1基因可明显抑制L9981肺癌细胞株的细胞增殖力和侵袭力.nm23-H1基因对人高转移大细胞肺癌细胞株L9981的生物学行为的影响可能与其抑制PKC信号传导有关.
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The Molecular Mechanisms of Nm23-H1 Gene Transfection on Reversing Invasion and Metastasis Phenotype in Human High-metastataic Large Cell Lung Cancer Cell Line L9981
Background: Our previous studies have proved that nm23-Hl gene was a tumor metastatic suppressive gene, tumor metastasis phenotype of human lung cancer could be reversed by transfection of nm23-H1 cDNA, but the molecular mechanism of nm23-H1 for inhibiting tumor invasion and metas-tasis is unclear. The aim of this study is to explore the molecular mechanism of nm23-Hl reversing the invasion and metastasis phenotype in human high-metastatic large cell lung cancer line L9981.
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The Molecular Mechanisms of Nm23-H1 Gene Transfection on Reversing Invasion and Metastasis Phenotype in Human High-metastataic Large Cell Lung Cancer Cell Line L9981
Background: Our previous studies have proved that nm23-Hl gene was a tumor metastatic suppressive gene, tumor metastasis phenotype of human lung cancer could be reversed by transfection of nm23-H1 cDNA, but the molecular mechanism of nm23-H1 for inhibiting tumor invasion and metas-tasis is unclear. The aim of this study is to explore the molecular mechanism of nm23-Hl reversing the invasion and metastasis phenotype in human high-metastatic large cell lung cancer line L9981.
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利用定点突变技术构建突变nm23-H1和EGFP融合基因
背景与目的以前的研究已经证明nm23-H1基因是肿瘤转移抑制基因,但其抑制肿瘤转移的分子机制目前还不完全清楚.基因定点突变技术可以精确地改变基因的特定碱基序列,获得突变蛋白质.本研究的目的是应用基因定点突变技术构建突变型nm23-H1-增强型绿色荧光蛋白(EGFP)融合基因,为进一步研究肿瘤抑制基因nm23-H1的功能、生化作用机制提供理论基础和实验依据.方法以逆转录病毒PLXSN野生型nm23-H1-EGFP质粒为突变模板,应用QuikChangeTM定点突变方法,简单、快速、高效地引入nm23H1S44A、nm23-H1P96S、nm23-H1H118F、nm23 H1 S120G四个点突变和一个联合位点突变nm23-H1 P96S-S120G,构建了突变型nm23-H1-EGFP融合基因.结果成功构建了nm23-H1S44A-EGFP、nm23-H1P96S-EGFP、nm23-H1H118F-EGFP、nm23-H1S120G-EGFP、nm23-H1 P96S-S120G-EGFP五个突变型nm23-H1-EGFP融合基因,经DNA序列分析突变的碱基序列与实验设计完全一致.结论成功构建了五个具有不同突变位点的突变型nm23-H1-EGFP融合基因.QuikChangeTM定点突变技术是一种简单、快速、高效的基因定点突变方法.
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nm23-H1基因转染前后人肺癌细胞中PKC转位的研究
目的探讨nm23-H1转染和蛋白激酶C(PKC)特异抑制剂Calphostin C对人高转移大细胞肺癌细胞株L9981细胞PKC信号转导通路的作用,以及nm23-H1基因对PKC激活转位的影响.方法应用激光扫描共聚焦显微镜观察nm23-H1基因转染前后和Calphostin C 处理转基因细胞株L9981-nm23-H1前后PKC 在不同的亚细胞区域的定位情况.结果 (1)原代细胞株L9981和空载体细胞株L9981-pLXSN中PKC-α、PKC-βⅡ主要位于胞核及核周,处于激活状态;转染nm23-H1基因后的人肺癌细胞株L9981-nm23-H1中PKC-α、PKC-βⅡ主要位于胞浆,处于未激活状态.(2)Calphostin C作用后所有细胞中的PKC 均主要位于胞浆中,处于未激活状态.结论 (1)nm23-H1基因可使L9981细胞株中PKC从胞核向胞浆转位,从而抑制PKC信号转导.(2)Calphostin C可使L9981、L9981-pLXSN细胞株中PKC从胞核向胞浆转位,从而抑制PKC信号转导.
关键词： nm23-H1 基因 激光共聚焦显微镜 PKC转位 人大细胞肺癌细胞株L9981 -
nm23-H1转染对肺癌细胞整合素分子表达的调控
目的通过基因转染方法将nm23-H1基因转入nm23-H1基因缺失的人高转移大细胞肺癌细胞株L9981,探讨nm23-H1基因对肺癌细胞整合素(integrin)分子表达的调控作用.方法应用阳离子脂质体介导的基因转染技术,将nm23-H1基因导入人高转移大细胞肺癌细胞株L9981;应用半定量RT-PCR技术检测nm23-H1基因转染前后integrin β1、integrin β3基因的mRNA表达;利用流式细胞仪技术检测nm23-H1基因转染前后integrin β1、integrin β3基因的蛋白表达.结果 (1)转染后获得稳定、高效表达nm23-H1基因的转基因肺癌细胞株L9981-nm23-H1,该细胞株的integrin β1、integrin β3 mRNA表达水平显著低于原代细胞株L9981.(2)转基因肺癌细胞株L9981-nm23-H1中integrin β1、integrin β3蛋白表达水平显著低于原代细胞株L9981(P＜0.01).结论 nm23-H1基因转染能显著下调人高转移大细胞肺癌细胞株L9981中integrin β1和integrin β3 mRNA和蛋白表达,表明nm23-H1基因可通过调控细胞integrin表达逆转人高转移大细胞肺癌L9981细胞株的转移潜能.
关键词： nm23-H1 人高转移大细胞肺癌细胞株 整合素 转移 -
nm23-H1基因对Tca8113的转移能力及化疗敏感性影响的实验研究
目的通过nm23-H1的转化及导入Tca8113细胞株,建立稳定、高效、低毒的转染方法,观察nm23-H1对Tca8113细胞株侵袭转移能力的影响.方法 利用基因转化技术,制备高纯度的nm23-H1真核表达质粒.利用阳离子脂质体介导的转染技术,完成转染方法的建立.利用免疫组化技术,检测转染前后的nm23-H1的蛋白产物核苷二磷酸激酶A (NDPKA)的表达.利用transwell小室和冲刷实验,观察转染前后细胞的侵袭、粘附、趋化运动能力的变化.MTT法观察nm23-H1对Tca8113化疗敏感性影响.结果 使用重组的pCMV-Neo-Bam真核表达载体,将nm23-H1转染口腔癌细胞,并获得稳定表达.Tca8113细胞株nm23-H1基因转染前后表达水平有明显差异,转染后Tca8113细胞侵袭、粘附、趋化运动能力均显著降低,转染前后Tca8113细胞株对阿霉素(ADM)、5-氟尿嘧啶(5-FU)、甲氨喋呤(MTX)的化疗敏感性无显著差异,转染后Tca8113细胞株对顺铂(CDDP)明显增敏.结论 nm23-H1对Tca8113细胞的侵袭转移能力具有显著抑制作用,nm23-H1可能通过特异性地影响细胞内的能量交换过程来达到对CDDP化疗增敏的效果.
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nm23-H1质粒和顺铂白蛋白联合治疗裸鼠移植瘤
目的研究nm23-H1质粒和顺铂白蛋白联合应用对裸鼠移植瘤的影响.方法将15只BALB/C雌性裸鼠随机等量分为3组,即对照组、顺铂白蛋白组和顺铂白蛋白+nm23-H1质粒组.每只裸鼠均皮下注射浓度为每毫升3.1×106个的舌鳞癌Tca8113细胞,2周后顺铂白蛋白+nm23-H1质粒组移植瘤瘤体内注射质粒-脂质体复合物,3 d后顺铂白蛋白+nm23-H1质粒组和顺铂白蛋白组瘤体内注射顺铂白蛋白.观察裸鼠的重量、移植瘤体积和瘤体重量的变化.结果对照组裸鼠重量轻.nm23-H1质粒和顺铂白蛋白联合治疗组肿瘤体积小,瘤体重量轻.结论nm23-H1基因治疗和顺铂白蛋白联合可以明显抑制裸鼠移植瘤的生长.
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腺病毒介导的nm23-H1对人恶性黑色素瘤A375体外抑制作用的研究
目的 观察Ad-GFP-nm23-H1抑制人恶性黑色素瘤(Malignant melanoma,MM)A375细胞生长和转移的作用,为后期nm23-Hl基因和腺病毒载体用于MM及其它肿瘤的基因治疗提供一定的理论和方法.方法 采用MTT法检测Ad-GFP-nm23-H1,对A375细胞增殖力的影响,用细胞基质胶黏附实验黏附力和侵袭能力实验来分别检测Ad-GFP-nm23-H1,对A375细胞粘附力和侵袭能力的影响.结果 Ad-GFP-nm23-Hl可以明显抑制A375细胞的增殖、黏附和侵袭能力,其抑制作用呈剂量一效应关系.结论 Ad-GFP-nm23-Hl,对人恶性黑色素瘤A375细胞的生长和转移具有抑制作用.
关键词： nm23-H1 人恶性黑色素瘤细胞A375 黏附 侵袭 -
PIM-1、nm23-H1、ErbB-3三种因子在前列腺癌组织中表达意义的初步研究
目的 探讨PIM-1、nm23-H1、ErbB-3三种因子在前列腺癌组织中表达意义.方法 采用RT-PCR法检测PIM-1和免疫组织化学法检测nm23-H1、ErbB-3的表达含量,进一步做统计学分析.结果 在60例前列腺癌组织标本中,PIM-1、ErbB-3、nm23-H1的相对表达量低分化组、中分化组与高分化组相比较有统计学意义P＜0.05;nm23-H1与肿瘤的分化程度为正相关,但与临床分期是负相关态势.结论 PIM-1和ErbB-3的表达和前列腺癌的发生发展呈正相关,而抑癌基因nm23-H1为负相关;希望通过进一步的科学设计实验,在前列腺癌的前期预测和鉴别诊断方面提供可靠的理论依据.
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nm23-H1基因转染对膀胱癌T-24细胞转移能力及化疗敏感性的影响
目的 探讨nm23-H1基因对人膀胱癌T-24细胞侵袭转移能力及化疗敏感性的影响.方法 将nm23-H1真核表达质粒通过电击穿孔转染技术导入人膀胱癌细胞株T-24, G418筛选阳性克隆,免疫组织化学方法检测nm23-H1基因的表达情况.Transwell小室和冲刷实验观察转染前后细胞的侵袭、粘附、趋化运动能力的变化.MTT法检测T-24细胞转染前后对化疗药物敏感性的变化.结果 以电穿孔技术将nm23-H1基因转入T-24细胞后,获得稳定表达;免疫组织化学结果显示T-24细胞株在nm23-H1基因转染前后其表达水平有明显差异;转染后T-24细胞侵袭、粘附、趋化运动能力有明显的降低.转染后T-24细胞对顺铂(CDDP)明显增敏.结论 nm23-H1基因对人膀胱癌T-24细胞的侵袭转移能力具有显著抑制作用.nm23-H1基因能增强T24细胞对顺铂的化疗敏感性.
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nm23H1蛋白在喉癌中的表达及临床意义
为探讨喉癌nm23-H1 蛋白表达与其生物学行为及淋巴结转移的关系,作者采用LSAB免疫组化方法,研究了86例喉癌手术标本中nm23-H1蛋白的表达情况.结果:喉癌原发灶中nm23-H1蛋白表达的阳性率为66.3%,其中无区域淋巴结转移者阳性率为90.5%,伴区域淋巴结转移者阳性率为43.2%,两者比较差异显著(P＜0.005).随着喉癌浸润深度和临床分期的进展,原发灶中nm23-H1蛋白表达阳性率逐渐下降;随着癌细胞组织学分级的升高,nm23-H1蛋白表达阳性率逐渐增高.由此提示,nm23-H1基因在喉癌的浸润和淋巴结转移过程中发挥了负性调控作用.
