重建牙本质-牙髓复合体样结构的实验研究

目的采用组织工程学的方法重建牙本质-牙髓复合体样结构.方法以大鼠牙髓干细胞为种子细胞,将羟基磷灰石-磷酸三钙(HA-TCP)复合支架材料接种至裸鼠背部皮下,8周后取材进行组织学及免疫组织化学检测.结果移植物组织学切片可见支架材料孔隙内有3层组织结构,由外向内分别为矿化牙本质、前期牙本质及牙髓组织,其中牙本质小管明显,牙髓组织外层细胞密集,部分出现极化,呈现出成牙本质细胞样细胞特征.免疫组织化学染色证实人牙本质特异性蛋白、DMP1在前期牙本质区及成牙本质细胞样细胞为阳性表达.结论采用牙髓干细胞为种子细胞、HA-TCP为支架材料可成功构建牙本质-牙髓复合体样结构,为进一步进行牙齿组织工程再造奠定基础.

人牙源性间充质细胞构建牙本质-牙髓复合体样结构的实验研究

目的以复合生长因子的陶瓷化骨和Collagraft为载体建立人牙源性间充质细胞的体内立体培养模型,构建牙本质-牙髓复合体样结构.方法将经生长因子诱导的人牙源性间充质细胞接种于复合同种生长因子的陶瓷化骨和Collagraft复合材料上,将细胞-支架复合物移植到裸鼠皮下,建立牙源性间充质细胞的体内立体培养模型.4周和10周后取材,对移植物进行组织学观察和人牙本质涎蛋白(DSP)的免疫组化染色.结果 10周的实验组标本中,植入细胞在复合生长因子支架上形成了较典型的牙本质-牙髓复合体样结构,人DSP在新生牙本质样组织中呈阳性表达.对照组及4周标本中未观察到此现象.结论用人牙源性间充质细胞和复合生长因子的陶瓷化骨或Collagraft支架材料在裸鼠体内可成功构建出牙本质-牙髓复合体样结构.

成体人牙髓干细胞的分离与鉴定

目的从成体人牙髓组织中分离培养牙髓干细胞,初步探讨其分化潜能.方法选取年轻患者因正畸或阻生拔除的健康第三磨牙,取出牙髓,采用酶消化及过滤法得到单细胞悬液,有限稀释法原代培养.扩大培养细胞克隆,检测STRO-1的表达.体外诱导分化后对各克隆从碱性磷酸酶(ALP)活性、矿化结节形成、牙本质涎蛋白(DSP)表达、Oil Red-O染色、PPARr2基因表达等方面进行检测.结果克隆来源细胞STRO-1表达阳性.在矿化液诱导下,克隆细胞呈现明显高的ALP活性;能够形成矿化结节;可以分泌表达DSP,已向成牙本质细胞方向发生了分化.成脂肪诱导后,Oil Red-O染色阳性,可检测到PPARr2基因表达.结论从成体人牙髓组织中可以分离培养出干细胞,在体外能有效增殖并保持低分化状态.

LIM矿化蛋白1在人牙髓及根尖牙乳头中的表达

目的 比较人年轻恒牙牙髓、根尖牙乳头及成熟恒牙牙髓组织中LIM矿化蛋白1(LIMmineralization protein-1,LMP-1)的表达,探寻LMP-1在牙髓牙本质复合体发育和成熟中的作用.方法 收集48颗因正畸拔除的健康前磨牙,其中年轻和成熟恒牙各24颗,样本来源对象的年龄分别为11 ～14岁和18 ～30岁.拔除后即刻分离获得年轻恒牙的牙髓和根尖牙乳头组织(各24个样本)以及成熟恒牙的牙髓组织(24个样本).实验分组如下:第1组为牙根形成2/3的年轻恒牙的根尖牙乳头组织；第2组为牙根形成2/3的年轻恒牙的牙髓组织；第3组为成熟恒牙的牙髓组织.每组12个样本用于反转录PCR(reverse transcription-PCR,RT-PCR)检测,另12个样本用于蛋白质印迹法检测,以β-肌动蛋白做内参.图像分析软件(Meta Morph 6.2.6)对阳性条带进行灰度值测定,目的条带与内参的灰度值比值为LMP-1的表达强度.应用SPSS13.0对数据进行统计学分析,LMP-1在年轻恒牙根尖牙乳头与牙髓组织之间的表达强度的两两比较采用两配对样本的t检验,年轻恒牙牙髓与成熟恒牙牙髓组织之间的表达强度的两两比较采用两独立样本的t检验,以双侧P＜0.05为差异有统计学意义.结果 LMP-1 mRNA在年轻恒牙的根尖牙乳头、牙髓和成熟恒牙的牙髓组织中的表达强度分别为0.25±0.09、0.46±0.24和0.31 ±0.10,经两样本t检验分析,LMP-1的基因表达在第2组年轻恒牙牙髓组织明显高于其在第1组年轻恒牙根尖牙乳头组织(t=2.92)以及第3组成熟恒牙牙髓组织的表达强度(t=2.31,P＜0.05).LMP-1蛋白在3组中的表达强度分别为0.33 ±0.08、0.82±0.10和0.52 ±0.19,LMP-1的蛋白表达在第2组显著高于第1组(t=3.33)及第3组中的表达强度(t =3.11,P＜0.05).结论 无论是在mRNA水平还是在蛋白水平,LMP-1在人年轻恒牙牙髓、根尖牙乳头以及成熟恒牙牙髓组织中均有不同程度的表达,提示LMP-1在牙髓牙本质复合体发育和成熟过程中可能发挥重要作用.

咬合创伤对口颌系统及全身的影响与矫治

咬合是口颌系统的重要功能结构,是完成口腔功能的重要组成部分,对保证口腔及全身健康 很重要.咬合创伤是口腔的常见疾病之一,以往认为咬合创伤是由于功能性或非功能性的力 量超过了牙周的适应和修复能力而引起的牙周创伤,表现为牙周组织的病损,然而咬合创伤无论与牙体、牙髓、牙周肌肉、颞下颌关节均有密切的关系[1-6];与口腔颌面的 各组织结构以及与全身各部位甚至中枢神经等各系统也密切相关,与口腔医学中的各个学科 均有联系.

生物活性玻璃-丝素蛋白复合膜支持人牙髓干细胞增殖与分化初探

目的 探讨生物活性玻璃45S5-丝素蛋白(bioactive glass 45S5-silk fibroin, BG45S5-SF)复合膜对人牙髓干细胞(human dental pulp stem cell,hDPSC)生长、增殖、分化的影响,为牙髓-牙本质复合体再生提供新思路和新方法.方法 制备纯丝素蛋白膜(蛋白膜组)、含不同质量浓度(1000和5000 mg/L)BG45S5-SF复合膜(复合膜A组和B组),以无材料膜的孔板为空白对照组.接触角仪测量蛋白膜组和复合膜组表面接触角(每组3个复孔).4组预孵24 h后接种hDPSC,培养第4、7、14、21天检测hDPSC增殖能力;扫描电镜和免疫荧光染色观察hDPSC黏附和生长;碱性磷酸酶活性评估hDPSC分化潜能;实时定量PCR检测hDPSC的成牙本质细胞向分化基因表达水平.结果 蛋白膜组、复合膜A组和B组表面接触角分别为89.51°±0.12°、70.32°±0.07°和71.31°±0.09°.hDPSC在丝素蛋白膜及BG45S5-SF复合膜上均黏附生长良好.复合膜A、B组第7、14、21天碱性磷酸酶活性及分化基因较空白对照组和蛋白膜组显著上调(P＜0.05).复合膜A组牙本质基质蛋白1、牙本质涎蛋白、碱性磷酸酶、骨钙蛋白mRNA表达第14天达峰值,复合膜B组第21天达峰值;复合膜A、B组骨涎蛋白mRNA表达均在第21天达峰值.结论 BG45S5-SF复合膜不仅能支持hDPSC黏附、生长与增殖,还能促进hDPSC的成牙本质细胞向分化,提示BG45S5-SF复合膜有促进牙髓-牙本质复合体再生的潜能.

FAM20C在体外培养人牙髓细胞中的表达及成牙本质向分化诱导对其表达的影响

目的：研究人牙髓细胞（hDPC）体外培养传代过程中FAM20C的表达模式，及对hDPC成牙本质向分化诱导后FAM20C的表达变化。方法蛋白免疫印迹法（Western blot）检测第1代至第7代（P1~P7）hDPC中FAM20C蛋白的表达量；结果采用独立样本t检验；对P3代hDPC进行成牙本质分化诱导7和14 d后，反转录聚合酶链反应与Western blot检测FAM20C的mRNA和蛋白水平变化。牙本质涎磷蛋白（DSPP）、牙本质基质蛋白1（DMP1）表达变化，FAM20C的mRNA以及蛋白表达变化采用单因素方差分析。免疫荧光法检测FAM20C在hDPC中的分布。结果体外培养的hDPC中可检测到FAM20C表达，表达量随细胞传代先增加后减少（tP2=-10.177，PP2=0.001；tP3=-18.242，PP3＜0.001；tP4=-19.143，PP4＜0.001；tP5=-7.452，PP5=0.002；tP6=1.357，PP6=0.246；tP7=1.099，PP7=0.334）；成牙本质向分化诱导7和14 d后，FAM20C的mRNA和蛋白表达量高于未诱导组细胞（FFAM20C mRNA=86.252， PFAM20C mRNA，7 d＜0.001，PFAM20C mRNA，14 d＜0.001；FFAM20C蛋白=85.569，PFAM20C蛋白，7 d=0.002，PFAM20C蛋白，14 d＜0.001）。免疫荧光结果显示，成牙本质诱导前FAM20C蛋白表达于细胞核，诱导后主要表达于细胞质，诱导14 d FAM20C在细胞质中表达量高于诱导7 d。结论 hDPC中表达FAM20C，成牙本质向分化诱导上调其表达水平，诱导后在细胞质中表达较高，提示FAM20C与hDPC的成牙本质分化相关。

牙龈卟啉单胞菌脂多糖诱导人牙髓细胞炎症反应中微小RNA的表达谱变化

目的 研究牙龈卟啉单胞菌脂多糖(Pg-LPS)诱导人牙髓细胞(hDPC)炎症反应中微小RNA(miRNA)表达谱的变化.方法 体外分离培养hDPC,10μg/ml Pg-LPS处理hDPC 0、3、6、12、24 h,实时荧光定量聚合酶链反应(PCR)和ELISA检测炎症因子白细胞介素6(IL-6)、IL-8 mRNA及蛋白表达量.Illumina HiSeqTM 2500测序检测Pg-LPS刺激前后miRNA表达模式,筛选差异miRNA并预测其靶基因,对靶基因进行KEGG通路和GO功能富集分析.采用t检验或单因素方差分析等进行统计分析.结果 Pg-LPS刺激hDPC,IL-6和IL-8的mRNA表达量及细胞上清蛋白含量显著升高,其中IL-6和IL-8 mRNA在3 h表达升高明显,分别为(7.4±1.1)、(61.6±20.8)倍,差异有统计学意义(tIL-6=-9.268,PIL-6=0.001;tIL-8=-5.047,PIL-8=0.037).IL-6和IL-8的分泌呈时间依赖性增加,24 h时含量分别为(44±19)、(4016±670)pg/ml,差异有统计学意义(tIL-6=-3.621,PIL-6=0.022;tIL-8=-4.902,PIL-8=0.008).hDPC经LPS刺激后共检测出680个miRNA表达有变化,其中2个下调的miRNA和18个上调的miRNA为差异miRNA,功能富集分析显示差异miRNA参与调控多条炎症或损伤修复相关的信号通路如Wnt信号通路、TGF-β信号通路、PI3K-Akt信号通路、MAPK信号通路等.结论 Pg-LPS可诱导hDPC发生炎症反应,此过程中miRNA表达谱发生变化,提示miRNA可能参与Pg-LPS诱导的hDPC炎症反应.

兔牙髓干细胞与Pluronic F-127嵌段共聚物的体外相容性

目的：探讨牙髓干细胞（DPSC）与Pluronic F?127水凝胶生物相容性。方法酶解组织块法获得DPSC，镜下观察细胞形态。制备20%、25%、30%（w/v）的Pluronic F?127水凝胶，扫描电镜（SEM）观察水凝胶支架空间形态，检测支架材料的溶胀率，凝胶化时间。用不同浓度Pluronic F?127水凝胶包封DPSC进行三维培养，并以普通培养皿的二维培养作为对照，镜下观察细胞生长情况。培养第1、3、5、7天通过噻唑蓝（MTT）法检测支架对DPSC增殖的影响。将佳浓度的Pluronic F?127用于包封DPSC，常规矿化液诱导14 d进行茜素红、甲苯胺蓝染色、实时荧光定量聚合酶链反应（PCR）检测成骨相关骨桥蛋白（OPN）、Ⅱ型胶原，以评价Pluronic F?127对DPSC成骨及成软骨分化的影响。数据分析采用单因素方差分析。结果成功分离并纯化DPSC，细胞在支架内生长良好；MTT结果显示：第1天各组间差异无统计学意义；第3天，20%Pluronic F?127组细胞增殖A标准值（0.774±0.095）显著高于其他培养组（A对照=0.353±0.096、A25%PF=0.559±0.053、A30%PF=0.532±0.093），差异有统计学意义（F=15.993，P=0.000）；第5天时，20%Pluronic F?127组细胞增殖A标准值（0.554±0.510）显著高于其他培养组（A对照=0.260±0.097、A25%PF=0.353±0.049、A30%PF=0.212±0.049），差异有统计学意义（F=20.821，P=0.000）。成骨及成软骨诱导后茜素红及甲苯胺蓝染色呈阳性，对照组呈阴性。实时荧光定量PCR显示，三维诱导组mRNA相对表达水平显著高于其他培养组，差异有统计学意义（FOPN=65.576，POPN=0.000；FCOL?2=38.382，PCOL?2=0.000）。结论20%Pluronic F?127适合DPSC的培养，并可支持其生长及分化。Pluronic F?127可作为DPSC的生物载体，有望成为理想的组织工程支架材料。

Toll 样受体4在人成牙本质细胞和牙髓组织中的表达

目的 探讨人牙髓组织和成牙本质细胞中Toll样受体4(TLR4)的表达与分布特点,及其在牙髓组织天然免疫防御中的可能作用.方法 从新鲜拔除的人第三磨牙获取牙髓组织和成牙本质细胞,扫描电镜观察牙髓摘除后髓腔壁成牙本质细胞形态和附着情况;RT-PCR检测人牙髓组织以及成牙本质细胞中TLR4mRNA的表达情况;采用免疫印迹技术和免疫组织化学方法检测TLR4蛋白的表达与定位.结果 扫描电镜观察牙髓摘除后成牙本质细胞大部存留在髓室壁上,细胞形态良好;RT-PCR结果发现健康牙髓、成牙本质细胞均可表达TLR4mRNA,产物大小为278 bp;免疫印迹法检测正常牙髓、成牙本质细胞在相对分子质量89 000附近出现蛋白条带;免疫组化显示牙髓组织中的成牙本质细胞、血管内皮细胞TLR4免疫反应阳性.正常牙髓中牙髓成纤维细胞不表达TLR4.结论 成牙本质细胞通过表达TLR4参与牙髓牙本质复合体的先天免疫反应,TLR4在牙髓抵御外来病原微生物入侵的宿主免疫防御中起重要作用.

牙髓干细胞对牙周炎中破骨细胞的作用

目的 研究牙髓干细胞(DPSC)对牙周炎中破骨细胞形成及牙槽骨再生的影响,并初步探索DPSC对小鼠破骨细胞的作用机制.方法 体外诱导小鼠骨髓单核细胞破骨分化,观察破骨细胞组(OC组)及其与DPSC共培养组(OC+DPSC组)的抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色情况,实时荧光定量聚合酶链反应(PCR)检测破骨分化相关基因包括活化T细胞核因子(NFATc1)、基质金属蛋白酶9(MMP-9)及TRAP的表达差异.体内构建小鼠慢性牙周炎模型,通过微计算机体层摄影(micro-CT)扫描后三维重建,比较慢性牙周炎+0.9%氯化钠溶液注射组(NS组)和慢性牙周炎+DPSC注射组(DPSC组)釉牙骨质界至牙槽嵴顶(CEJ-ABC)距离,并对标本进行苏木精-伊红和TRAP染色,观察DPSC对小鼠破骨细胞及牙槽骨再生的影响.采用SPSS 20.0软件进行数据统计分析,采用独立样本t检验及校正t检验分析组间差异.结果 体外TRAP染色发现,与DPSC共培养明显抑制成熟破骨细胞形成,OC+DPSC组成熟破骨细胞均数(4.2 ± 0.2)少于OC组均数(6.8 ± 0.2),差异有统计学意义(t=15.922,P<0.001);破骨细胞表面积均数(0.046 ± 0.007)mm2也明显小于OC组(0.763 ± 0.015)mm2,差异有统计学意义(t=83.174,P<0.001).相对OC组,OC+DPSC共培养组的MMP-9、NFATc1及TRAP的mRNA相对表达量明显降低,均值分别为0.38 ± 0.17(t=6.217,P=0.003)、0.24 ± 0.12(t=10.569, P=0.003)和0.55 ± 0.13(t=6.077,P=0.026).micro-CT扫描结果显示,DPSC注射组CEJ-ABC的平均距离为(0.215 ± 0.017)mm,明显小于0.9%氯化钠溶液组(0.311 ± 0.022)mm,差异有统计学意义(t=10.921,P<0.001),组织学观察下DPSC组炎症反应较0.9%氯化钠溶液组轻,且破骨细胞更少.结论 DPSC可通过抑制牙周炎破骨细胞的形成从而促进牙槽骨再生,有望作为一种可局部注射的骨代谢双向调节生物制剂,治疗临床上包括牙周炎等因骨代谢失衡引起的炎症性骨吸收疾病.

核苷酸结合寡聚化结构域2在人炎症牙髓组织中的表达

目的 研究人炎症牙髓组织中核苷酸结合寡聚化结构域2(NOD2)的表达与分布特点,探讨NOD2 在牙髓组织天然免疫防御中的可能作用.方法 荧光定量聚合酶链反应(qPCR)检测人正常和炎症牙髓组织中NOD2 mRNA 的表达情况; 采用免疫组织化学染色和免疫印迹方法(Western blot)检测人正常和炎症牙髓组织中NOD2 蛋白的定位和表达差异.结果 荧光qPCR结果表明,炎症牙髓组织NOD2 mRNA 的表达水平显著高于正常牙髓组织;Western blot 检测到正常和炎症牙髓组织在96 kDa 附近均出现蛋白条带,且炎症牙髓组织NOD2 表达水平高于正常牙髓组织;免疫组织化学显示,炎症牙髓组织中大量炎性细胞NOD2 强阳性表达,成纤维细胞NOD2 蛋白也有明显表达,而正常牙髓组织中成纤维细胞未见NOD2 蛋白表达.结论 NOD2 可能参与牙髓的炎症和免疫反应,推测其可能在牙髓抵御外来病原微生物入侵的宿主免疫防御中发挥作用.

血管内皮生长因子和骨形成蛋白2诱导犬恒牙原位牙髓再生

目的 通过选择犬根尖孔发育完成的恒牙建立根尖周炎模型,探索血管内皮生长因子(VEGF)和骨形态生成蛋白2(BMP2)诱导原位牙髓再生的可能性.方法 2只10~12月龄的杂种犬,选择根尖孔发育完成的14颗恒前牙建立根尖周炎模型,分别将VEGF(VEGF组)、BMP2(BMP2组)单独和VEGF+BMP2联合(VEGF+BMP2组)与水凝胶复合植入感染控制后的根管腔内,对照组仅植入水凝胶.8周后组织学观察根管内组织再生情况.结果 植入8周后,VEGF组和VEGF+BMP2组根管腔内可见含有大量成纤维样细胞和血管的新生组织形成;而BMP2组和对照组根管腔内见均质状物质,未见细胞、血管形成.结论 VEGF或VEGF+BMP2复合水凝胶支架可以诱导犬根尖发育成熟的根尖周炎患牙在根管腔内生成含有血管的疏松结缔组织.

人牙髓细胞来源外泌体对脐静脉内皮细胞迁移能力的影响

目的 探讨牙髓细胞外泌体(DPC-Exos)对脐静脉内皮细胞(HUVEC)迁移能力的影响.方法 超速离心法分离提纯DPC-Exos,透射电镜和蛋白印迹法(Western blot)进行鉴定;划痕实验和Transwell实验检测DPC-Exos对HUVEC迁移的影响.采用SPSS 20.0软件进行分析,划痕实验迁移率和Transwell实验细胞迁移数采用两独立样本的t检验进行统计.结果 DPC-Exos呈双层膜包被和茶托样结构,表达CD63膜蛋白标记物.划痕实验结果显示,DPC-Exos作用6 h后HUVEC细胞迁移能力下降26%,差异具有统计学意义(t=6.534,P<0.001).Transwell实验结果显示,DPC-Exos作用6 h后HUVEC迁移能力下降32%,差异具有统计学意义(t=5.846,P<0.001).结论 DPC-Exos抑制HUVEC迁移.

成牙本质细胞在牙髓免疫防御中的作用研究进展

成牙本质细胞是牙髓牙本质复合体中的特征性细胞,主要功能是合成、沉积和矿化胶原基质从而形成牙本质.成牙本质细胞的功能不仅局限于牙本质的形成,作为牙髓的第一道细胞防线,可通过模式识别受体(PRR)识别多种病原相关分子模式(PAMP),启动免疫防御反应.本文就成牙本质细胞的组织生理学特点及其在牙髓炎症免疫防御中的作用作一综述.

畸形中央尖折断临床防治新进展

畸形中央尖是一种临床常见的牙齿发育异常,表现为牙齿形态异常、牙齿牙合面突起的结节.受咬合创伤可引起畸形中央尖折断或磨损,使得髓角或牙本质暴露,引起牙髓感染、坏死,严重者可导致根尖周炎.由于年轻恒牙萌出早期即可出现畸形中央尖折断,牙根生长发育常受到影响,严重影响口腔健康.因此,对畸形中央尖患牙采取积极措施,预防畸形中央尖折断或早期干预去除畸形中央尖极其重要.本文就国内外学者对畸形中央尖折断的防治理念及相关治疗药物作一综述.

乳牙牙髓干细胞的研究进展

乳牙牙髓干细胞（SHED）来源于脱落的乳牙牙髓，具有较强的增殖能力、自我更新能力、多向分化潜能，而且乳牙为生物废弃物，符合伦理要求，所以渐渐成为干细胞领域研究的新热点。本文就SHED的生物学特征、培养方法、鉴定方法、多向分化潜能及其在疾病治疗中应用的研究进展作一综述。

国家级继续教育项目"牙体牙髓疑难病例的显微治疗临床新进展"研修班通知

现代牙髓治疗学

宾夕法尼亚大学推行的现代牙髓治疗理念,旨在以文献为佐证,以追求完美的态度严格选择适应证进行牙髓非手术和手术治疗.这一理念主要体现在四个方面:遵循生物学原则、术者接受系统培训、使用现代化仪器与设备以及追求完美的意愿.

人牙龈上皮细胞上清液对牙髓细胞增殖及分化影响的研究

目的:研究体外培养的人牙龈上皮细胞(human gingival epithelium cells,HGECs)上清液对人牙髓细胞(human dental pulp cells,HDPCs)增殖及分化的影响,探讨在体外建立HGECs和HDPCs共培养模型的可行性.方法:采用组织块法分别进行HGECs和HDPCs原代培养,收集第2、4、6d的HGECs上清液,均以10%、30%、50%浓度作用于HDPCs,MTT法测定HDPCs增殖情况,通过测定细胞裂解液中ALP水平研究对HDPCs分化的影响,以加入相应浓度的上皮细胞培养基K-SFM为对照.结果:加入不同浓度的第2、4、6d的HGECs上清液后HDPCs的增殖均上升,并有促进HDPCs分化的作用,而对照组则抑制了HDPCs增殖和分化.结论:体外培养HGECs的上清液能够促进HDPCs增殖和分化.