首页 > 文献资料
-
HIF-1α基因修饰的牙髓干细胞成血管的体外研究
目的:探讨低氧诱导因子1α(hypoxia inducible factor 1α,HIF-1α)基因对体外诱导牙髓干细胞(dental pulp stem cells,DPSCs)成血管分化方法并进行鉴定.方法:取拔除的健康、完整的前磨牙标本20例,提取DPSCs细胞,采用Strol-1、CD146分子进行鉴定.根据DPSCs是否转染HIF-1α基因分为实验组和对照组,RT-PCR法测定HIF-1αmRNA表达,Western印迹检测培养1、4、7、14 d不同时间段HIF-1α及成血管相关因子VEGF、SDF-1、Ang-2及PDGF的表达情况.采用SPSS16.0软件包对数据进行统计学分析.结果:倒置相差显微镜观察,DPSCs多数细胞呈圆形、椭圆形类,免疫荧光观察到Strol-1、CD146均呈绿色荧光.实验组HIF-1α蛋白、mRNA随着时间的延长,表达水平越来越高,差异显著(P＜0.05).实验组转染后1、4、7、14 d后与对照组相比,HIF-1α蛋白、mRNA显著增高(P＜0.05).对照组血管相关因子VEGF、SDF-1、Ang-2和PDGF随时间的延长,其表达水平无显著差异(P＞0.05).实验组VEGF、SDF-1、Ang-2和PDGF随培养时间延长,其表达水平逐渐升高,不同时间点间差异显著(P＜0.05).与对照组相比,转染后1、4、7、14 d差异显著(P＜0.05).结论:HIF-1α基因修饰DPSCs能够成功体外诱导其血管分化作用,为进一步血管形成研究奠定了基础.
-
干细胞表面标志物在牙髓干细胞中的表达
目的:探讨磁珠分选后培养的人牙髓干细胞的表面标记抗原随培养代数增加的变化情况.方法:改良组织块法培养的人牙髓细胞,至第2代(P2)时,用磁珠方法分选出STRO-1阳性细胞,用流式细胞术分别检测P2、P3、P4、P5、P6、P7、P8代的干细胞表面标志物CD73、CD90、CD105、CD166、STRO-1.取P3代细胞,分别进行成骨诱导和成脂诱导.21 d后,分别行茜素红染色和油红O染色,观察矿化物形成情况和脂滴形成情况,同时以未诱导细胞为对照.结果:STRO-1在牙髓干细胞表面随代数增加而下降,CD73、CD90、CD105、CD166的表达比较稳定,茜素红染色可见矿化结节形成,油红O染色显示形成大量脂滴.结论:STRO-1在牙髓干细胞表面随代数增加而下降,其他干细胞标志物比较稳定.
-
转导hTERT基因致人牙髓干细胞永生化的研究
目的:建立永生化人牙髓干细胞系(human dental pulp stem cell,hDPSC),供口腔医学临床和基础研究使用.方法:原代培养人牙髓细胞并筛选牙髓干细胞,以慢病毒为载体,导入端粒酶反转录酶基因(hTERT)全长cDNA,经筛选得到阳性克隆.体外连续传代,应用反转录PCR(reverse transcription PCR,RT-PCR)和蛋白质印迹技术(Westernblot)检测hTERT的整合和表达情况.结果:成功地将hTERT基因转入人牙髓干细胞,得到的转化细胞端粒酶表达阳性,增殖旺盛,至今已传至第35代.结论:转导外源性hTERT基因可以导致人牙髓干细胞永生化.
-
体外培养的冠髓和根髓细胞中碱性磷酸酶的活性
目的:比较根部和冠部牙髓培养细胞的碱性磷酸酶活性,探讨牙髓干细胞在牙髓中的定位.方法:用组织块法分别培养根髓、冠髓细胞,用Gomori碱性磷酸酶染色法对根、冠髓培养细胞在加入条件孵育液(20%DMEM+10nmol/L地塞米松+10mmol/L β-甘油酸钠+50mg/L L-抗坏血酸)后的第5、10、15天的碱性磷酸酶活性进行测定,从牙髓干细胞的功能角度,探讨其在牙髓中的定位.结果:根髓、冠髓细胞均出现碱性磷酸酶染色阳性,染色强度在第5天无差别,在第10、15天根髓染色强度大于冠髓.结论:碱性磷酸酶的活性在根髓中大于冠髓.牙髓干细胞可能存在于全部牙髓之中,其密度在根髓中大于冠髓.
-
牙髓培养细胞特性与牙髓干细胞定位
目的:比较人牙根髓与冠髓培养细胞的特性,探讨牙髓干细胞在牙髓中的定位.方法:用组织块法分别培养人根髓、冠髓细胞,观察并比较两者的培养成功率、细胞贴壁率、细胞活性、增殖特性、细胞形态以及细胞诱导矿化能力,以探讨牙髓干细胞在牙髓组织中的定位.结果:培养的根髓细胞比冠髓细胞具有较高的成功率和贴壁率、较强的细胞活性以及相同的增殖活性,根髓细胞比冠髓细胞的形态更具有原始性,根髓比冠髓更易诱导矿化.结论:牙髓干细胞可能存在于全部牙髓之中,在根髓中比冠髓中具有更高的密度.
-
GLUD1基因对人牙髓干细胞的体外增殖、分化和矿化的影响
目的:探索谷氨酸脱氢酶1 (Glutamate dehydrogenase 1,GLUD1)基因在人牙髓干细胞(human dental pulp stem cells,hPDCSs)体外增殖、成骨分化和矿化中的作用.方法:体外分离培养hPDCSs,利用慢病毒感染方式沉默GLUD1基因的表达,分别采用RT-PCR和Western免疫印迹检测mRNA及蛋白水平的沉默效率.采用CCK8法检测细胞的体外增殖水平.对hDPSC进行体外成骨诱导分化培养,采用茜素红染色法检测矿化结节的形成,利用RT-PCR和免疫荧光染色分别检测Runx2、OCN基因的表达.采用SPSS 20.0软件包对数据进行统计学分析.结果:hDPSCs经过成骨诱导分化培养后,GLUD1的表达量较对照组明显上升;hDPSCs经shGLUD1病毒转染后,GLUD1表达明显下调;沉默GLUD1表达的hDPSCs体外增殖能力减弱;经成骨诱导分化培养后,与对照组相比,矿化结节形成明显减少;成骨早期标志基因Runx2上调,成骨晚期标志物OCN在mRNA和蛋白水平均显著下调.结论:沉默GLUD1表达抑制hDPSCs的体外增殖和矿化形成,影响晚期成骨分化;GLUD1在hDPSCs的成骨分化中具有重要作用.
-
肾上腺髓质素对人牙髓干细胞增殖和分化的影响
目的 探讨肾上腺髓质素(adrenomedullin,ADM)对人牙髓干细胞(dental pulp stem cells,DPSCs)增殖、成牙本质分化能力的影响.方法 体外培养的人DPSCs传至第3代,培养液中加入不同浓度ADM(10-6、10-7及10-8 mol/L)处理细胞24 h,并设置空白对照组.流式细胞术检测细胞周期及细胞凋亡,定量PCR和蛋白质印迹法检测成牙本质分化标记物碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)的mRNA及蛋白表达.结果 细胞周期检测结果显示,3种浓度ADM干预DPSCs后G2/S/M期细胞比例均较空白对照组上升(P＜0.05),但各干预组间差异无统计学意义;细胞凋亡检测结果显示,3种浓度ADM干预组的Annexin V+/PI-标示细胞比例均较空白对照组下降(P＜0.05),但各干预组间差异无统计学意义;定量PCR及蛋白质印迹检测结果显示,DPSCs中ALP mRNA及蛋白表达较空白对照组上升(P＜0.01),但各干预组间差异无统计学意义.结论 ADM具有促进DPSCs的增殖、抑制凋亡及促其向成牙本质分化的作用.
-
体外培养人牙髓干细胞的生物学特性
目的 研究体外培养的人牙髓干细胞的生物学特性.方法 收集因正畸拔除的第一前磨牙,用酶消化法分离能够形成克隆且具有高增殖力的细胞,细胞以低密度接种传代培养;免疫荧光法检测第3代细胞表面标志的表达;取第4代细胞,用含有20%胎牛血清、地塞米松、β甘油磷酸钠和维生素C的培养液诱导3周,茜素红染色观察诱导后细胞矿化情况,免疫荧光法检测牙本质涎蛋白(DSP)表达,改良Kaplow氏法检测诱导前后碱性磷酸酶的表达.结果 诱导前细胞表达Stro-1、Cbfa-1、和Ⅰ型胶原,碱性磷酸酶呈弱表达,不表达DSP;诱导后细胞表达DSP,碱性磷酸酶呈强表达,并可见钙结节形成.结论 分离所得细胞具有较高的增殖和分化能力,与间充质干细胞具有相似的表面标志,并在诱导后表达DSP而具备牙髓干细胞的特征.
-
淫羊藿苷对大鼠牙髓干细胞增殖及成骨分化的影响
目的 探讨淫羊藿苷对大鼠牙髓干细胞(dental pulp stem cells,DPSCs)增殖和成骨的影响.方法 采用组织块消化法获得大鼠牙髓细胞,克隆化分离培养大鼠DPSCs,流式细胞术检测细胞表面标志CD105、CD34和CD44的表达情况,以成骨分化培养基为对照组,以加入1×106mol/L淫羊藿苷的成骨分化培养基为实验组,细胞计数试剂盒8(CCK-8)检测各组DPSCs的增殖能力的变化,茜素红染色法检测各组钙结节形成的差异,Real-time PCR检测各组骨形态发生蛋白2(BMP-2)、骨钙素(OCN)和Runt相关转录因子-2(Runx-2)等成骨相关基因的相对表达量.结果 DPSCs高表达CD44和CD105,低表达CD34,实验组DPSCs增殖速度较对照组明显加快(P＜0.05),淫羊藿苷明显增强了DPSCs的钙结节形成能力,且实验组BMP-2、OCN和Runx-2基因相对表达量明显高于对照组.结论 淫羊藿苷对大鼠DPSCs增殖和成骨分化具有促进作用.
-
糖尿病大鼠牙髓干细胞增殖及成牙/成骨分化能力研究
目的:探讨高血糖大鼠牙髓干细胞(DPSCs)增殖及成牙/成骨分化能力.方法:选取3个月龄糖尿病模型动物GK大鼠及正常对照Wistar大鼠,测定尾静脉血糖值,待血糖稳定1周后,通过酶消化法分离培养两组大鼠DPSCs,通过MTT法测定两组大鼠DPSCs生长曲线,实时定量RT-PCR及Western blot检测两组大鼠DPSCs牙本质基质蛋白1(DMP1)、Osterix(Osx)、骨钙素(OCN)等成牙/成骨向分化指标的表达.结果:GK大鼠餐后2小时尾静脉血糖值稳定在20.1~22.3 mmol/L,Wistar大鼠为5.8~6.3 mmol/L.MTT结果显示,GK大鼠DPSCs增殖能力从培养第3天到第7天均较Wistar大鼠DPSCs低(P<0.05).实时定量RT-PCR及Western blot检测结果显示GK大鼠DPSCs成牙/成骨向分化指标的表达明显较正常对照Wistar大鼠低.结论:高血糖大鼠DPSCs增殖能力及成牙/成骨向分化能力均较正常大鼠低.
-
白藜芦醇促进氧化应激状态牙髓干细胞在钛种植体表面的增殖及成骨分化
目的:观察白藜芦醇(RSV)对氧化应激状态人源牙髓干细胞(hDPSCs)在大颗粒喷砂酸蚀表面改性的钛片表面增殖及成骨分化的影响.方法:采用酶消化法体外分离培养hDPSCs,200μmol/L H2 O2作用24 h诱导hDPSCs产生氧化应激状态,10μmol/L RSV处理氧化应激状态的hDPSCs 24 h;AlamerBlue法观察hDPSCs增殖活性的改变,扫描电镜观察hDPSCs在钛表面黏附及形态的改变,碱性磷酸酶(ALP)染色观察hDPSCs在钛片表面成骨分化能力的改变.结果:氧化应激状态的hDPSCs增殖能力比正常对照组显著降低,RSV能够显著提高氧化应激状态hDPSCs的增殖能力,并能促进其在钛片表面ALP的表达.结论:RSV能够促进氧化应激状态的hDPSCs在钛片表面增殖及成骨分化.
-
中药黄芩苷对牙髓干细胞增殖及成牙成骨分化能力的影响
目的：探讨中药黄芩苷对牙髓干细胞的增殖、成牙／成骨分化能力的影响。方法：酶消化法原代培养人牙髓干细胞，采用甲基噻唑基四唑（ MTT）比色法检测黄芩苷对人牙髓干细胞增殖的影响，碱性磷酸酶活性检测及Western blot等方法检测黄芩苷作用于人牙髓干细胞后，其成牙／成骨分化指标，包括核心结合因子（runt-related transcription factor 2，RUNX2）、牙本质涎蛋白（ dentin sialoprotein，DSP）、Osterix（ OSX）、骨桥蛋白（ osteopontin，OPN）、骨钙素（ osteocalcin，OCN）的变化。结果：MTT检测结果显示，0～20μmol／L黄芩苷作用于牙髓干细胞后其增殖能力与对照组相比无明显差异（P＞0．05）；而碱性磷酸酶活性检测显示：0～20μmol／L黄芩苷各浓度组细胞ALP活性比对照组明显增加（P＜0．01）；Western blot结果表明：与对照组相比，20μmol／L黄芩苷可增强牙髓干细胞RUNX2、DSP、OSX、OPN、OCN等成牙／成骨相关蛋白的表达。结论：黄芩苷对牙髓干细胞的增殖无明显影响，但可促进其成牙／成骨分化能力。
-
青霉素和链霉素对炎症牙髓干细胞的增殖、成牙成骨分化能力及 TNF-α表达的影响
目的：探讨青霉素和链霉素对炎症牙髓干细胞的增殖、成牙成骨分化能力及肿瘤坏死因子α（ tumor necrosis factor α， TNF-α）表达的影响。方法：采用酶消化法分离培养炎症牙髓干细胞，采用甲基噻唑基四唑（MTT）比色法、碱性磷酸酶活性检测、Western blot及实时定量RT-PCR等方法分析青霉素和链霉素作用于炎症牙髓干细胞后，其增殖和成牙成骨分化指标（核心结合因子、牙本质涎蛋白/牙本质涎磷蛋白、骨钙素）及TNF-α表达的变化。结果：青霉素和链霉素作用于炎症牙髓干细胞后，与未加抗生素的培养组细胞的增殖能力及成骨/成牙相关蛋白、基因的表达无明显差异（P＞0．05），而TNF-α的表达则低于普通培养组（P＜0．01）。结论：青霉素和链霉素降低炎症牙髓干细胞的炎性因子TNF-α表达，对细胞的增殖及成牙/成骨分化能力无明显影响。
-
PGC-1α-shRNA慢病毒载体对牙髓干细胞分化的影响
目的:构建过氧化物酶体增殖物激活受体γ辅激活因子1α(peroxisome proliferators activated receptor γ coactivator 1α,PGC-1α)短发夹RNA(short hairpin RNA,shRNA)慢病毒表达载体,体外评价其对牙髓干细胞(dental pulp stem cells,DPSC)分化的影响.方法:根据shRNA设计原则,设计合成用于体内干扰PGC-1α编码序列的shRNA,重组入慢病毒载体PLKO.1.将构建正确的PLKO.1/PGC-1α-shRNA感染DSPC,实时荧光定量PCR检测PGC-1α的表达,细胞化学染色和实时荧光定量PCR检测其对DPSC分化的影响.结果:测序证实重组质粒构建成功;体外试验表明,DPSC转染了PGC-1α-shRNA后PGC-1α表达水平降低,干扰效率达81%,而且细胞钙化结节增多,牙本质涎磷蛋白和Ⅰ型胶原的表达明显上调,与对照组相比具有显著性差异(P＜0.05).结论:慢病毒介导的PGC-1α-shRNA成功在体外抑制了目的基因的表达,并影响牙髓干细胞的分化.
-
牙髓干细胞干性维持的影响因素
牙髓干细胞是从牙髓组织中分离得到的一种牙源性间充质干细胞,具有自我更新能力和多向分化潜能,可分化为成骨、成脂及神经细胞等,且相对于其他干细胞较易获得,不存在伦理纠葛,是近年来牙齿再生医学的研究热点.本综述从内源性因素和微环境两个方面阐述牙髓干细胞的生物学特性及其干性维持的相关影响因素.
-
BMP-2促进人炎症牙髓干细胞骨向诱导分化的体外研究
目的：研究人骨形态发生蛋白-2（bone morphogenetic protein，BMP-2）对人炎症牙髓组织来源的牙髓干细胞（dental pulp stem cells from inflamed pulps，DPSCs-IPs）体外骨向诱导分化的影响。方法：取第三代 DPSCs-IPs，按是否于培养基中加入 BMP-2分成：BMP-2＋DPSCs-IPs 组（实验组）和 DPSCs-IPs 组（对照组）。无成骨诱导条件培养1周后，对各组分泌的胶原基质行 Tri-chrome 染色，观察并比较实验组和对照组之间的骨向诱导分化情况；实时定量 RT-PCR 检测二者的Ⅰ型胶原蛋白（collagenⅠ，COL-Ⅰ）mRNA 表达情况。在成骨诱导条件下，培养3周后对各组分泌的钙化基质行 Von Kossa 染色，通过实时定量 RT-PCR 检测转录因子及成骨相关基因的表达。结果：无成骨诱导培养1周后，实验组 DPSCs-IPs 分泌的胶原基质 Trichrome 染色较对照组深， COL-ⅠmRNA 的表达水平显著上调（P ＜0．05），说明 BMP-2可诱导 DPSCs-IPs 沉积更多的胶原基质；成骨诱导培养3周后，相对于对照组，实验组 DPSCs-IPs 沉积了更多的钙化基质，Nanog、八聚体结合转录因子4（octamer-binding transcription factor 4，Oct4）、性别决定区因子（SRY-related high-mobility group box 2，Sox2）等转录因子表达升高，碱性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）、骨钙素（osteocalcin，OCN）、骨涎蛋白（bone sialoprotein，BSP），牙骨质蛋白1（cementum protein 1，CEMP-1）、COL-Ⅰ等成骨相关基因表达水平显著上调（P ＜0．05）。结论：BMP-2在成骨诱导条件下可促进 DPSCs-IPs 进行体外骨向诱导分化。
-
牙髓干细胞生物学性能影响因素的研究进展
牙髓干细胞是早体外成功分离培养的牙源性干细胞，具有较强的增殖能力及多向分化能力，是组织工程牙再生、骨再生研究中极具潜能的种子细胞。牙髓干细胞的生物学性能容易受到外界环境的影响，进而影响其在组织工程中的应用，因此选择一个适合牙髓干细胞培养的微环境是非常重要的。本文基于现有文献，从细胞因子、条件培养液、支架材料、物理因素等对牙髓干细胞生物学性能的影响展开综述。
-
骨桥蛋白影响矿化液诱导牙髓干细胞成骨分化能力的研究
目的 研究骨桥蛋白(osteopontin,OPN)对矿化液诱导牙髓干细胞(dental pulp stem cells,DPSCs)成骨分化能力的影响,并优化其诱导条件.方法 矿化液培养DPSCs作为对照组,在矿化液培养基础上添加适宜浓度OPN作为实验组,在倒置相差显微镜下观察诱导后的DPSCs形态变化;应用茜素红染色法检测矿化结节的形成;采用反转录聚合酶链反应(reversetranscription polymerase chain reaction,RT-RCR)分别检测DPSCs骨涎蛋白(BSP)、Runt相关转录因子2(Runx-2)、骨钙蛋白(OCN)、Ⅰ型胶原(Col-1)等骨源性基因表达情况.结果 茜素红染色显示诱导培养28 d后两组均出现矿化结节,且实验组的数量和大小明显高于对照组.培养7d后两组DPSCs骨源性基因表达均成阳性,且实验组中BSP、Runx-2、Col-1及OCN等基因表达水平均明显高于对照组.结论 OPN能增强矿化液诱导DPSCs成骨分化的能力.
-
免疫磁珠筛选大鼠牙髓干细胞、外胚间充质干细胞的表型研究
目的 检测磁珠分离细胞STRO-1+的DPSC、EMSC中HNK-1 、Nestin的表达,进一步了解DPSC的表型特点及与EMSC的相关性,为今后研究提供较为纯化的细胞来源.方法 采用间接免疫磁珠分离法获得DPSC、EMSC,间接免疫荧光双标法检测抗原HNK-1 、Nestin的表达.结果 磁珠分离前后进行细胞计数,大约有5％的DPSC为STRO-1+的细胞,大约有1％的EMSC为STRO-1+的细胞;STRO-1+的DPSC免疫荧光检测同时表达HNK-1(++)、Nestin(+),STRO-1+的EM-SC免疫荧光检测显示也同时表达HNK-1(++)、Nestin(++).结论 免疫磁珠分离法获得STRO-1+阳性的DPSC共表达EMSC的标记HNK-1和Nestin,进一步说明二者作为间充质来源的干细胞,细胞表型具有继承性.
-
脱矿牙本质基质对人牙髓干细胞体外增殖、牙向分化能力的影响
目的 观察脱矿牙本质基质(demineralized dentin matrix,DDM)与人牙髓干细胞(human dental pulp stem cells,hDP-SCs)的生物相容性及其作为支架材料的牙向诱导作用.方法 体外分离培养DPSCs,分别用四唑盐比色法(MTS)、茜素红染色法、碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)和逆转录聚合酶链式反应(reverse transcription- polymerase chain reaction,RTPCR)方法观察DDM生物材料对DPSCs增殖活性和牙向分化能力的影响.结果 DDM显著地刺激体外培养的DPSCs增殖,诱导了细胞的矿化和提高细胞ALP活性.RT- PCR结果显示DDM诱导后细胞mRNA水平表达牙本质涎磷蛋白(dentin sialophosphoprotein,DSPP)和牙本质基质蛋白(dentin matrix protein1,DMP -1).结论 体外培养条件下,DDM与DPSCs有良好的生物相容性,作为支架材料对于DPSCs有较好牙向诱导作用.
