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应用免疫磁珠集菌法首次从漯河市动物粪便中检出O157:H7大肠杆菌
近年来,O157:H7大肠杆菌在许多国家发生暴发流行,我国自1986年先后在江苏、山东等地分离到此菌,并出现散发病例.自1999年以来,河南有个别县市相继不断出现EHEC感染病例.为了解我市是否有O157:H7流行疫情,采集动物粪便96份,用O157大肠杆菌病原体快检金卡预检阳性者进行免疫磁珠分离,阴性者不再进行检测,现将结果报告如下.
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免疫磁珠富集联合荧光定量PCR快速检测牛肉馅中产志贺毒素大肠埃希菌O26∶H11
目的 建立肉制品中免疫磁珠富集(IMS)联合实时荧光定量PCR(qPCR)技术快速检测牛肉馅中产志贺毒素大肠埃希菌(STEC) O26∶ H11的方法.方法 建立针对编码O26抗原wzx基因实时荧光定量PCR方法,并验证其特异性和敏感性;人工污染不同浓度STEC O26∶H11的牛肉馅样品,在增菌不同时间后,将增菌液原液、增菌液经免疫磁珠特异性捕获分离物分别进行qPCR检测及平板分离.结果 qPCR检测O26∶ H11可产生特异性荧光信号,而23株其他血清型的大肠埃希菌及7株其他种属细菌均未见荧光信号;本方法对纯培养的检测限为5 × 102 cfu/ml.人工染菌试验中,当初始染菌浓度达到或高于3×102 cfu/25 g时,增菌培养6h后IMS捕获物可以检测到荧光信号.培养20 h后,初始染菌浓度为3×10-1 cfu/25 g以上,对增菌液直接检测和IMS捕获物检测都可以检测到荧光信号.初始污染浓度较低时,增菌6h后IMS-qPCR的检测灵敏度高于增菌液直接qPCR检测;IMS捕获物涂布显色培养基分离目标菌检测灵敏度高于增菌液直接涂布;CHROMagar STEC显色培养基分离STECO26∶H11的检测灵敏度高于山梨醇麦康凯培养基(SMAC).结论 IMS联合qPCR检测食品中的STEC O26∶ H11具有特异性强、敏感度高、快速、易操作等特点,可以提高样品中STEC O26∶ H11菌的检出率,适用于牛肉制品中STEC O26:H11的快速检测.
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基于核酸适配体技术对清开灵注射液中胆酸的研究
目的 利用免疫磁珠分离技术和核酸适配体相结合的方法剔除清开灵注射液中胆酸小分子,借此研究胆酸在清开灵注射液对细胞脱颗粒中的作用.方法 将标记有生物素的胆酸的核酸适配体与表面有链霉亲和素包被的磁珠偶联,然后将偶联物与清开灵注射液进行孵育,使胆酸与核酸适配体特异结合,后利用磁性分离将清开灵注射液中的胆酸剔除.对胆酸剔除前后的清开灵注射液进行细胞脱颗粒实验,以研究其类过敏反应的性质.结果 磁珠与适配体的偶联反应具有浓度依懒性.适配体剔除清开灵注射液中的胆酸也具有浓度依懒性.剔除部分胆酸后的清开灵注射液对细胞的脱颗粒作用,与清开灵注射液相比,有显著下降.结论 利用胆酸的核酸适配体与免疫磁珠分离技术能够剔除清开灵注射液中的胆酸,为研究小分子物质在中药注射液中的作用提供了新的研究方法.
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免疫磁珠两步法分离小鼠脾脏CD4+CD25+调节性T细胞
体外分离CD4+CD25+调节性T细胞(CD4+CD25+Treg)并进行初步鉴定.用磁性细胞分离器(MiniMACS)分离CD4+CD25+Treg细胞,流式细胞术(flow cytometry,FCM)分析细胞纯度和Foxp3蛋白表达,体外检测细胞因子.MACS分离的CD4+CD25+Treg细胞纯度大于90%,细胞存活率大于93%,并且特异性表达Foxp3蛋白,体外能抑制CD4+CD25-Treg分泌IFN-γ,同时CD4+CD25+Treg能分泌抑制性细胞因子TGF-β1、IL-10.结果显示,通过MACS可分离高纯度、高活性的CD4+CD25+Treg细胞.
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从粪便中分离隐孢子虫用于全基因组测序的研究
目的 使用新的方法直接从少量粪便样品中分离和纯化隐孢子虫卵囊,并进行全基因组扩增(whole genome amplification,WGA),从而获得符合全基因组测序要求的隐孢子虫DNA. 方法 10份新鲜牛源隐孢子虫粪便样品,用蔗糖和氯化铯离心法分离卵囊,然后使用免疫磁珠试剂盒纯化;用漂白水进行卵囊表面消毒,以除去细菌及真菌等病原微生物.采用QIAamp DAN Mini kit试剂盒提取基因组DNA,然后采用REPLI-g MIDI kit试剂盒进行WGA,后,采用定量PCR对基因组DNA进行量和纯度检测. 结果 分离纯化后的卵囊计数为2.81×104个/g～2.90×107个/g.提取基因组DNA后进行WGA,所有扩增产物均为大分子片段,表明WGA成功.WGA产物的DNA浓度为55.3ng/μl～357.5 ng/μl.隐孢子虫SSU rRNA基因的定量PCR扩增显示,10份样品纯化WGA产物的CT值范围为9.75～17.76,其中有7个样品CT＜15,满足全基因组测序要求. 结论 直接从粪便中分离和纯化隐孢子虫卵囊再进行WGA,可使隐孢子虫的基因组DNA浓度和纯度能达到测序要求,该方法使隐孢子虫全基因测序常规化是可行的.
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免疫磁珠分离涂片和PCR检测痰内结核分枝杆菌的诊断价值研究
目的:探讨免疫磁珠分离涂片染色镜检法和免疫磁珠分离-PCR法对痰标本中结核分枝杆菌的诊断价值.方法:利用纯化的兔抗H37Rv血清包被磁珠,对痰中结核分枝杆菌进行分离,再进行涂片和PCR检测.结果:免疫磁珠分离涂片法比直接涂片法(χ2=40.83,P=0.039)、免疫磁珠分离-PCR法比常规PCR(χ2=23.31,P<0.01)的灵敏度高.结论:免疫磁珠分离涂片法和磁珠分离-PCR法因操作简单、阳性率高,适宜在临床上推广使用.
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免疫磁珠筛选大鼠牙髓干细胞、外胚间充质干细胞的表型研究
目的 检测磁珠分离细胞STRO-1+的DPSC、EMSC中HNK-1 、Nestin的表达,进一步了解DPSC的表型特点及与EMSC的相关性,为今后研究提供较为纯化的细胞来源.方法 采用间接免疫磁珠分离法获得DPSC、EMSC,间接免疫荧光双标法检测抗原HNK-1 、Nestin的表达.结果 磁珠分离前后进行细胞计数,大约有5％的DPSC为STRO-1+的细胞,大约有1％的EMSC为STRO-1+的细胞;STRO-1+的DPSC免疫荧光检测同时表达HNK-1(++)、Nestin(+),STRO-1+的EM-SC免疫荧光检测显示也同时表达HNK-1(++)、Nestin(++).结论 免疫磁珠分离法获得STRO-1+阳性的DPSC共表达EMSC的标记HNK-1和Nestin,进一步说明二者作为间充质来源的干细胞,细胞表型具有继承性.
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应用免疫磁珠分离法纯化弓形虫速殖子的研究
目的用免疫磁珠分离法分选弓形虫速殖子，以去除宿主细胞成分，并尽可能对虫体的生物学特性无不良影响，为弓形虫的基础与临床研究提供技术基础。方法采用弓形虫Wh3株( China 1基因型)速殖子感染小鼠，提取腹腔液，常规方法制备速殖子可溶性抗原，免疫家兔，获得兔抗弓形虫多克隆IgG抗体。用抗体包被的免疫磁珠对小鼠腹腔液内弓形虫速殖子进行纯化，比较其纯度、回收率、虫体活力、毒力与感染性。结果用免疫磁珠分离技术纯化弓形虫速殖子后，其纯度提高到98.2%，细胞清除率为96%，虫体回收率为73.5%；用内盐法( MTS )细胞增殖与毒性检测试剂盒检测分离后的速殖子活性为95.6%。定量分组感染小鼠后死亡时间无显著性差异。结论免疫磁珠分离的速殖子纯度、细胞清除率和虫体回收率较高，能有效去除宿主细胞，且对速殖子的活性和毒力无影响。该法操作简便快速，无需昂贵的仪器设备，具有较大的实用价值。
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免疫磁分离-荧光PCR应用在肉类单增李斯特氏菌的检测
目的建立适用于肉类产品中单核增生李斯特氏菌的荧光PCR检测方法.方法根据单增李斯特氏菌溶血素基因hlyA,设计合成引物和荧光探针,结合免疫磁珠筛选,选择简便的DNA提取方法,建立适用于检测肉类制品中单增李斯特氏菌的荧光PCR方法.对该方法进行特异性、灵敏度及模拟样品检测效果的研究.结果对20株不同菌属的标准菌株和30株野生李斯特氏菌菌株,及混合菌液的检测,结果显示该方法具有良好的特异性.对染菌模拟样本的检测结果表明,经过24h增菌,该方法的检测低限为1cfu/g,整个流程只需27 h.结论免疫磁分离-荧光PCR方法为快速、简便和准确检测肉类制品中单增李斯氏菌提供了一个新的途径.
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保健食品中沙门菌的快速检测方法
沙门菌(Salmonella)是革兰氏阴性无芽孢杆菌,寄生在人类和动物肠道内,该菌有200多种,致病菌只占少数,如伤寒、副伤寒沙门菌.引起食物中毒或败血症,如鼠伤寒沙门菌、肠炎沙门菌等十余种.因此,对该病菌的检测和对该病的有效防治显得尤为重要.对沙门菌进行快速检测,及早发现传染源,切断传播途径,是有效地防治沙门菌病的手段.
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商丘市、济源市腹泻患者、家禽、家畜粪便中E.coli O157:H7的鉴定
目的:对商丘市、济源市从腹泻患者和家禽、家畜粪便中首次分离的E.coli O157:H7进行生物学特性等方面的研究.方法:采集疫区患者、外环境、家畜和家禽粪便标本1 895份,采用mEC肉汤增菌、胶体金免疫卡快速测定法、免疫磁珠集菌法、CHROMAGAR-O157:H7 显色培养基分离及多重PCR分析毒力基因等方法进行病原菌的分离和检测.结果:共分离出137株E.coli O157:H7菌株,在CHROMAGAR-O157:H7 显色培养基生长形态、颜色,生化反应出现多样化,rfbO157、stx2、hlyA、eaeA基因检测均阳性的有58株,stx2阳性1株,eaeA阳性4株,72株无毒力基因.结论:为本省实验室诊断E.coli O157:H7提供了理论依据;不同种类的家禽、家畜分离的产毒菌株比例差别显著,以波尔山羊为突出;为今后在制定对该菌的诊断标准、传染源的追踪和控制及细菌毒力学等方面的研究提供了重要线索.
关键词： E.coli O157:H7 多重PCR分析 毒力基因 免疫磁珠分离 -
羟基淀粉沉淀对免疫磁珠法分离脐血CD34+细胞及造血祖细胞增殖功能的影响
目的:应用羟基淀粉沉淀去除脐血红细胞和免疫磁珠(MACS)阳性选择,建立富集、分离脐血CD34+细胞的简易实用方法,通过造血祖细胞集落培养分析其在细胞因子作用下的增殖潜能,观察羟基淀粉沉淀对造血细胞增殖功能的影响.方法:采用羟基淀粉沉淀和改进的MACS富集、分离脐血CD34+细胞,以甲纤半固体造血细胞培养法观察其粒-单系细胞(CFU-GM)和红系爆式集落(BFU-E)的数量和特性.结果:脐血分离前,CD34+细胞纯度为1.5%～3%,MACS分离后其纯度可达85%,羟基淀粉沉淀和MACS分离可达91%;CD34+造血祖细胞培养有明显的增殖,采用IL-3、IL-6、SCF、GM-CSF、EPO等细胞因子组合扩增培养9～14 d,CD34+细胞在液体培养中有明显扩增,MACS分离后CD34+细胞总数增加39倍,羟基淀粉沉淀和MACS分离可增加45倍.结论:应用羟基淀粉沉淀和改进的MACS系统可有效富集、分离脐血CD34+细胞,羟基淀粉沉淀对CD34+细胞的富集、分离无影响;脐血细胞分离后作造血祖细胞培养,可产生丰富的CFU-GM和BFU-E,说明羟基淀粉沉淀分离的CD34+细胞的增殖功能优于MACS分离CD34+细胞的增殖功能.
