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5-氮杂-2'-脱氧胞苷对人肝癌细胞株SMMC7721增殖及DAPK mRNA表达的影响
目的:探讨去甲基化药物5-氮杂-2'-脱氧胞苷(5-Aza-2'-deoxycytidine,5-Aza-CdR)对人肝癌细胞株SMMC7721细胞增殖以及对死亡相关蛋白激酶(Death-associated protein kinase,DAPK)基因mRNA表达水平的影响.方法:用不同浓度(0.5,5.0,50.0 μmol/L)的5- Aza-CdR对SMMC7721细胞处理后,采用MTT法检测细胞的增殖情况；半定量RT- PCR法检测各组细胞DAPK mRNA的表达水平.结果:5-Aza-CdR对肝癌细胞株SMMC7721生长有明显抑制作用,并且存在剂量依赖性反应关系(F =242.40,P＜0.01)；半定量RT- PCR结果显示,MMC7721细胞中DAPK mRNA表达水平很弱,采用不同浓度5-Aza-CdR处理SMMC7721细胞72 h后,SMMC7721细胞中DAPK mRNA表达水平呈剂量依赖性逐渐升高(F=360.41,P＜0.01).结论:5-Aza-CdR可诱导MMC7721细胞DAPK mRNA表达,并抑制SMMC7721细胞增殖.
关键词： 肝癌细胞 5-氮杂-2'-脱氧胞苷 死亡相关蛋白激酶 DNA甲基化 细胞增殖 -
5-氮杂-2'-脱氧胞苷抑制肾癌细胞增殖的机制研究
目的 探讨5-氮杂-2’-脱氧胞苷(5-Aza-CdR)抑制肾癌细胞增殖的分子机制.方法 采用不同浓度的5-Aza-CdR作用于769-P和ACHN 2种肾癌细胞,处理72 h后CCK-8法检测其对细胞增殖的影响;5-Aza-CdR处理769-P细胞48 h后,流式细胞仪测定细胞周期分布,RT-PCR测定甲基化转移酶DNMT1、DNMT3a、DNMT3b以及细胞信号抑制因子3(suppressor of cytokine signaling 3,SOCS3)的表达,Western blot测定SOCS3、P21在蛋白质水平的表达;siRNA干扰SOCS3表达以后,加5-Aza-CdR处理769-P细胞48 h,Western blot检测细胞内SOCS3、P21的表达.结果 5-Aza-CdR可以剂量性依赖地抑制肾癌细胞系769-P和ACHN的增殖(P＜0.05),且使769-P细胞阻滞在G2/M期.RT-PCR检测发现,5-Aza-CdR可以下调DNMT1和DNMT3a的表达和上调SOCS3的表达(P＜0.05).Western blot检测发现5-Aza-CdR可以促进SOCS3蛋白质的表达,并且伴随着P21蛋白的升高.在干扰SOCS3的表达后,用5-Aza-CdR处理769-P细胞48 h,P21的表达明显降低.结论 5-Aza-CdR通过抑制甲基化转移酶,增强SOCS3介导P21的表达,从而抑制肾癌细胞769-P增殖.
关键词： 5-氮杂-2'-脱氧胞苷 肾细胞癌 细胞增殖 细胞信号抑制因子3 p21 -
乳腺癌细胞中PNRC基因启动子区CpG岛甲基化状态的研究
目的 研究乳腺癌细胞中富含脯氨酸核受体辅活化子(proline-rich nuclear receptor coactivator protein,PNRC)基因启动子CpG岛的甲基化状态及在PNRC转录调节中的作用.方法 应用PT-PCR检测PNRC基因在正常乳腺细胞与乳腺癌细胞中的表达情况,并运用"MethPrimer"软件对PNRC启动子区进行分析,预测CpG岛,通过甲基化特异性PCR(methylation-specific PCR,MSP)检测PNRC启动子区CpG岛的甲基化状况;PT-PCR及Northern杂交检测乳腺癌细胞经甲基转移酶抑制剂5-氮杂-2'-脱氧胞苷(5-aza-2'-deoxycytidine,5-Aza-dc)作用后,PNRC基因mRNA的表达情况;Westernblot检测5-Aza-dc干预对PNRC蛋白表达的影响;将含PNRC启动子序列的报告质粒转染乳腺癌细胞,再经5-Aza-dc处理后,检测PNRC基因启动子的活性.结果 PNRC基因在乳腺癌细胞中的表达较正常乳腺细胞明显降低;乳腺癌细胞PNRC基因启动子区存在CpG岛甲基化;乳腺癌细胞经5-Aza-dc处理后,PNRC基因mRNA及蛋白表达水平显著增加,其PNRC基因启动子的活性也明显增强.结论 PNRC基因启动子区的高甲基化导致PNRC在乳腺癌细胞中表达降低.
关键词： PNRC DNA甲基化 MSP 5-氮杂-2'-脱氧胞苷 -
p16与非小细胞肺癌临床病理的关系及5-Aza-CdR对肺癌A549细胞中p16表达的影响
目的 探讨抑癌基因p16在非小细胞肺癌(non-small cell lungcancer,NSCLC)组织中的表达与临床病理参数间的联系,进一步研究DNA甲基转移酶抑制剂5-氮杂-2′-脱氧胞苷(5-Aza-2′-deoxycytidine,5-Aza-CdR)在人肺癌A549细胞中对p16表达的影响.方法 采用免疫组化SP法检测76例NSCLC组织及其癌旁正常组织中p16蛋白的表达情况,并分析不同病理参数癌组织中p16蛋白表达的差异;采用MSP法检测不同浓度(0～16 μmol/L) 5-Aza-CdR处理后的A549细胞中p16基因启动子区DNA的甲基化状态,并采用Western blot法检测5-Aza-CdR对A549细胞中p16表达的影响.结果 76例NSCLC组织中,32例(42.11％)p16蛋白表达阳性,低于癌旁正常组织(59例,77.63％)中阳性表达(P＜0.05);不同病理组织分级、肿瘤分化程度、临床TNM分期及有无淋巴结转移的NSCLC组织中p16的阳性表达率差异有统计学意义(P＜0.05);在A549细胞中p16蛋白表达和非甲基化产物均呈低表达状态,5-Aza-CdR作用后,p16蛋白和其非甲基化产物表达均上调,且随着5-Aza-CdR浓度的升高呈增多趋势.结论 p16在鳞癌、低分化、有淋巴结转移及Ⅲ～Ⅳ期NSCLC组织中低表达,提示其失活可能与NSCLC的进一步进展有关,5-Aza-CdR可诱导A549细胞中p16蛋白和非甲基化产物表达增加.
关键词： 非小细胞肺癌 p16基因 5-氮杂-2'-脱氧胞苷 肺癌细胞株A549 -
血管内皮生长因子C在胃癌的表达及5-氮杂-2'-脱氧胞苷的影响
目的:探讨血管内皮生长因子C(Vascular endothelial growth factor C,VEGF-C)在胃癌的表达及去甲基化试剂5-氮杂-2'-脱氧胞苷(5-Aza-2'-deoxycytidine,5-Aza-CdR)对其表达的影响.方法:免疫组化法检测68例胃癌切除标本的VEGF-C蛋白表达与Flt-4阳性微脉管密度(Flt-4-positive vessel density,FVD)、微血管密度(microvessel density,MVD),同时采用逆转录-聚合酶链反应(reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR)检测7株胃癌细胞株的VEGF-CmRNA表达,观察5-Aza-CdR干预对其表达的影响.结果:胃癌组织VEGF-C表达阳性率为54.4%(37/68),与FVD 、MVD及淋巴侵犯显著相关.VEGF-C mRNA表达于5株胃癌细胞株,2株(MKN-45,MKN-74)未测到VEGF-CmRNA表达,但以5-Aza-CdR处理后恢复表达.结论:VEGF-C与胃癌Flt-4阳性微脉管、MVD及淋巴侵犯显著相关,其表达可能受甲基化调控.
关键词： 胃癌 血管内皮生长因子C 免疫组化 5-氮杂-2'-脱氧胞苷 -
5-Aza-2'-dc预处理致敏百草枯对V79细胞活性氧及Bcl-2/Bax表达的影响
目的 研究DNA甲基化酶抑制剂5-氮杂-2'-脱氧胞苷(5-Aza-2'-dc)与百草枯联合对V79细胞作用后的活性氧含量及抗凋亡Bcl-2蛋白和促凋亡Bax蛋白表达的影响.方法 V79细胞经传代培养后分为5-Aza-2'-dc作用组(A组)、百草枯作用组(B组)、5-Aza-2'-dc加百草枯作用组(C组,即先应用5-Aza-2'-dc对V79细胞进行预处理12h,然后给予百草枯作用12h)、对照组(D组).采用2,7二氯荧光黄双乙酸盐(DCFH-DA)荧光探针装载,流式细胞仪测定各实验组V79细胞内活性氧含量,Western blot检测各实验组V79细胞内抗凋亡Bcl-2蛋白和促凋亡Bax蛋白的表达情况.结果 5-Aza-2'-dc与百草枯联合作用组(C组)V79细胞内活性氧含量、抗凋亡Bcl-2蛋白、促凋亡Bax蛋白表达与5-Aza-2'-dc组(A组)、百草枯组(B组)和对照组(D组)比较有统计学差异(P＜0.05);C组V79细胞内抗凋亡Bcl-2蛋白表达、抗凋亡Bcl-2蛋白/促凋亡Bax蛋白比值降低,活性氧含量和促凋亡Bax蛋白表达升高.结论 5-Aza-2'-dc调控DNA甲基化可能通过活性氧代谢失衡、细胞调亡来促进百草枯对V79细胞的毒性损伤.
关键词： 5-氮杂-2'-脱氧胞苷 百草枯 V79细胞 活性氧 Bcl-2/Bax -
高糖诱导人肾小球系膜细胞CTGF启动子去甲基化及基因表达
目的:观察高糖刺激和甲基化抑制剂5-氮杂-2-脱氧胞苷(5-aza-dCyd)对人肾小球系膜细胞(HMCs)结缔组织生长因子(CTGF)基因启动子的甲基化水平和基因表达的影响.方法:用不同终浓度的5-aza-dCyd(0、1、2、5、10 μmol/L)刺激HMCs,于48h提取细胞基因组DNA、总RNA和蛋白质;用不同浓度的葡萄糖(5 mmol/L、30 mmol/L)刺激细胞,于0、24、48、72 h收集细胞;应用甲基化特异性PCR(MSP)检测细胞CTGF基因启动子甲基化状态,RT-PCR检测CTGFmRNA表达,Western blot检测 CTGF 蛋白表达.结果:不同浓度5-aza-dCyd处理HMCs 48 h后,0、1、2、5 μmol/L 5-azadcyd组CTGF基因启动子呈半甲基化状态,均有微量CTGFmRNA和蛋白的表达,差异无统计学意义(均P＞0.05);10 μmol/L 5-aza-dCyd组甲基化条带阴性,呈完全去甲基化状态,CTGF mRNA和蛋白表达均增加,与0 μmol/L组比较差异有统计学意义(P＜0.01).5 mmol/L葡萄糖组HMCs各时间点CTGF基因启动子均呈半甲基化状态,表达微量CTGFmRNA和蛋白质,差异无统计学意义(均P＞0.05);30 mmol/L葡萄糖组CTGF启动子在0 h呈半甲基化状态,甲基化条带较强;24 h甲基化条带减弱,48 h甲基化条带阴性,呈完全去甲基化状态,24 h、48 h、72 h CTGF mRNA和蛋白质表达均增加,与5 mmol/L组相应时间点比较差异有统计学意义(均P＜0.05).结论:高糖和甲基化抑制剂5-aza-dCyd均可诱导人肾小球系膜细胞CTGF基因启动子的去甲基化并增加CTGF的表达,提示DNA甲基化可能参与了人肾小球系膜细胞CTGF基因表达的调控.
关键词： 高糖 系膜细胞 结缔组织生长因子 DNA甲基化 5-氮杂-2'-脱氧胞苷 -
5-氮杂-2'-脱氧胞苷对食管鳞癌ECa109细胞增殖及TIG1基因表达与甲基化状态的影响
目的:探讨5-氮杂-2'-脱氧胞苷(5-aza-2'-deoxy-cytidine,5-aza-CdR)对食管鳞癌细胞株ECa109增殖抑制作用,以及对ECa109中TIG1基因甲基化状态及其mRNA表达的影响.方法:实验组分别使用10、20、50、100μmol/L的5-aza-CdR处理ECa109细胞,对照组用不添加5-aza-CdR培养基培养;采用MTT法检测两组细胞生存率的变化;MSP检测TIG1基因的甲基化状态;RT-PCR法检测TIG1基因mRNA表达水平.结果:5-aza-CdR可以显著抑制ECa109的生长,实验组细胞生存率显著低于对照组,差异有统计学意义(P<0.01).实验组同种药物浓度,作用时间延长,生存率显著降低,差异有统计学意义(P<0.01);同一作用时间,随着药物浓度增加,细胞生存率降低,差异有统计学意义(P<0.01).对照组ECa109细胞TIG1基因处于高甲基化状态,经过10μmol/L及20μmol/L的5-aza-CdR处理细胞株120h后,TIG1基因的甲基化部分解除.对照组ECa109细胞中无TIG1 mRNA表达,采用10μmol/L及20μmol/L浓度药物处理72、120、168h后细胞株中TIG1 mRNA恢复表达,且20μmol/L处理组细胞较10μmol/L组TIG1 mRNA表达增强.结论:5-aza-CdR可以抑制ECa109细胞生长,且具有剂量及时间依赖性;ECa109中TIG1基因甲基化阳性,其mRNA的表达缺失;经5-aza-CdR干预后可使TIG1基因发生去甲基化修饰,恢复表达,去甲基化修饰具有时间及剂量依赖效应.
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胰腺癌Panc-1细胞TFPI-2基因甲基化状态与其体内体外侵袭能力的关系
目的:探讨甲基化酶抑制剂5-氮杂-2'-脱氧胞苷(5-aza-2-deoxycytidine,5-Aza-dC)对胰腺癌Panc-1细胞体内体外侵袭能力及裸鼠皮下移植肿瘤组织TFPI-2基因甲基化状态及表达的影响.方法:用不同浓度的5-Aza-dC处理胰腺癌Panc-1细胞.Transwell法测定各组Panc-1细胞的体外侵袭能力.将用药物处理过的各组Panc-1细胞分别接种于裸鼠皮下,观察各组成瘤率及肿瘤大小.用MSP及RT-PCR检测裸鼠移植瘤组织TFPI-2基因甲基化状态及TFPI-2基因mRNA表达情况.结果:与对照组相比,药物处理组Panc-1细胞体外侵袭能力明显下降,裸鼠成瘤率明显降低,第八周时,肿瘤体积明显低于对照组(P<0.05).与对照组相比,TFPI-2基因异常甲基化状态在药物处理组裸鼠移植瘤组织中得到逆转,药物处理组移植瘤TFPI-2基因mRNA重新表达,并呈剂量依赖性(P<0.05).结论:甲基化酶抑制剂5-氮杂-2'-脱氧胞苷可能在一定程度上抑制人胰腺癌Panc-1细胞系的体内体外侵袭和生长能力,其机制可能与逆转TFPI-2基因高甲基化状态从而恢复其表达有关.
关键词： 胰腺癌 组织因子途径抑制物-2 5-氮杂-2'-脱氧胞苷 甲基化 -
5-Aza-CdR对人喉鳞癌Hep2细胞凋亡及蛋白质表达的影响
目的:探讨5-Aza-CdR对人喉鳞癌Hep2细胞凋亡及蛋白质表达的影响.方法:Hep2细胞分别经10-7mol/L 5-Aza-CdR和DMSO处理72h,应用Hoechst33258染色及流式细胞仪检测5-Aza-CdR对Hep2细胞凋亡的影响.抽提各组Hep2细胞总蛋白质,行双向电泳,采用PDQuest-7.0.1软件及MALDI-TOF质谱技术筛查5-Aza-CdR对Hep2细胞蛋白表达的影响,并通过Western blot对显著性差异蛋白质进行验证.结果:人喉鳞癌Hep2细胞在10-7mol/L 5-Aza-CdR处理72h后出现明显的细胞核致密浓染,Hep2细胞的凋亡率由对照组的(2.70±0.28)%增加到(13.96±0.41)%,具有统计学意义(P＜0.05).双向电泳筛查了包括S100A4在内的5种表达显著差异的蛋白质,Western blot进一步验证了5-Aza-CdR能明显上调喉鳞癌Hep2细胞中S100A4的表达,进而证明了双向电泳结果的可信性.结论:5-Aza-CdR介导的Hep2细胞部分蛋白质表达改变,直接或间接地参与了5-Aza-CdR诱导的Hep2细胞凋亡的发生,为5-Aza-CdR在喉鳞癌探讨性治疗中的机制研究奠定基础.
关键词： 喉鳞癌 5-氮杂-2'-脱氧胞苷 凋亡 双向电泳 -
5-氮杂-2'-脱氧胞苷逆转RASSF1A基因甲基化对人乳腺癌MCF-7细胞的影响
目的:探讨启动子甲基化对乳腺癌MCF-7细胞RASSF1A基因的作用及5-氮杂-2'-脱氧胞苷(5-Aza-CdR)干预对启动子甲基化的影响,为临床治疗乳腺癌奠定理论基础.方法:用1,3,5,7,9 μmol/L不同浓度的5-Aza-CdR处理MCF-7乳腺癌细胞株,通过MTT检测5-Aza-CdR对MCF-7乳腺癌细胞株存活率的影响;建立5 μmol/L,10 μmol/L的浓度梯度流式细胞仪检测5-Aza-CdR对MCF-7乳腺癌细胞株生长周期及凋亡率的影响,MSP(甲基化PCR)检测5-Aza-CdR处理前后RASFF1A抑癌基因的甲基化状态,RT-PCR检测处理前后抑癌基因RASSF1A mRNA表达情况.结果:5-Aza-CdR抑制体外培养的人乳腺癌MCF-7细胞,诱导人乳腺癌MCF-7细胞凋亡和细胞周期停滞在G0/G1期,呈浓度依赖性.经5-Aza-CdR处理人乳腺癌MCF-7细胞后,MSP检测RASSF1A基因发生了甲基化,RT-PCR检测RASSF1AmRNA恢复了表达.结论:RASSF1A基因启动子甲基化是导致其失活的主要原因,5-Aza-CdR可以逆转乳腺癌细胞株MCF-7细胞RASSF1A基因启动子甲基化状态,使其重新表达.
关键词： MCF-7细胞 rassfia基因 5-氮杂-2'-脱氧胞苷 -
5-氮杂-2'-脱氧胞苷对HepG2中抑癌基因MIA2表达的影响
目的 应用甲基化酶抑制剂5-氮杂-2'-脱氧胞苷(5-Aza-2'-deoxycytidine,5-Aza-CdR)作用肝癌细胞株HepG2,观察其对细胞增殖和凋亡的影响,并观察用药后肝癌细胞中黑色素瘤抑制蛋白2(melanoma inhibitory activity 2,MIA2)表达的变化情况.方法 分别以浓度0、1、2、4、8、10、20、40μmol/L的5-Aza-CdR作用HepG2细胞,MTT法检测细胞增殖,流式细胞术检测细胞凋亡.再以0μmol/L和10μmol/L的5-Aza-CdR作用HepG2细胞,细胞免疫组化和Western blot检测细胞中MIA2蛋白表达.结果 5-Aza-CdR作用HepG2后,MTT结果显示细胞增殖受到抑制,在一定药物浓度范围内,细胞增殖抑制率和药物浓度呈正相关;流式细胞术结果显示细胞早期凋亡增加,在一定药物浓度范围内,早期凋亡率和药物浓度呈正相关;细胞免疫组化和Western blot结果显示与对照组(0μmol/L)比较,10μmol/L组中MIA2蛋白表达增强.结论 5-Aza-CdR 作用HepG2细胞后,MIA2蛋白表达明显增强,细胞增殖受到抑制,早期凋亡增加.
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5-氮杂-2'-脱氧胞苷对人脐静脉内皮细胞血管生成的影响及机制研究
目的 观察5-氮杂-2'-脱氧胞苷(5-Aza-CdR)对人脐静脉内皮细胞(HUVECs)血管生成的影响,并初步探讨其机制.方法 采用MTT法检测5-Aza-CdR对人脐静脉内皮细胞增殖的影响,利用Transwell小室研究5-Aza-CdR对HUVECs细胞迁移的影响,利用Matrigel胶模拟细胞外基质成分分析5-Aza-CdR对HUVECs细胞管样结构形成的影响,通过Western Blot法检测其对HUVECs细胞血管内皮生长因子受体(VEGFR2)表达的影响.结果 5-Aza-CdR可有效抑制HUVECs细胞增殖,且效果呈剂量、时间依赖性,1μmol/L、5μmol/L和10μmol/L 5-Aza-CdR在24 h时对HUVECs细胞的增殖抑制率分别为(2.5±0.2)%、(12.7±0.2)%和(29.3±0.2)%,差异有显著性(P<0.05);在72 h时对HUVECs细胞的增殖抑制率分别为(12.6±0.7)%、(67.1±0.2)%和(95.8±1.2)%,差异有显著性(P<0.05).与对照组相比,各浓度5-Aza-CdR均对HUVECs的迁移表现出显著的抑制作用.当浓度为1μmol/L、5μmol/L和10μmol/L时,抑制率分别为12.8%、28.6%、59.4%.不同浓度的5-Aza-CdR可明显抑制管样结构形成,1μmol/L、5μmol/L和10μmol/L的5-Aza-CdR对管样结构形成的抑制率分别为19.3%、37.2%和74.6%.用不同浓度的5-Aza-CdR处理HUVECs后,VEGFR2表达的下调呈剂量依赖性.结论 5-Aza-CdR可显著抑制HUVECs细胞增殖、迁移和管样结构形成,其机制可能与下调HUVECs细胞膜表面VEGFR2的表达有关.
关键词： 5-氮杂-2'-脱氧胞苷 人脐静脉内皮细胞 迁移 管样结构 血管内皮生长因子受体 -
5-氮杂-2'-脱氧胞苷抑制肿瘤的机制研究进展
恶性肿瘤目前已成为我国慢性病中死亡率高的疾病,因为其发生机制复杂,对其抑制的药物也一直处于研究状态.随着国内外研究的不断进展,发现诸多肿瘤抑制剂,但是作为广谱的抑制剂5-氮杂-2'-脱氧胞苷的效果虽已被初步证实,但是具体的机制仍在研究之中,从目前新的研究进展出发,重点阐述5-氮杂-2'-脱氧胞苷对肿瘤的关键抑制机制,为后续研究提供思路和依据.
关键词： 5-氮杂-2'-脱氧胞苷 肿瘤 去甲基化 抑制剂
