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钙整合素结合蛋白1慢病毒干扰载体的构建及表达
目的：构建人钙整合素结合蛋白1(calcium- and integrin-binding protein 1, CIB1)基因 RNA 干扰慢病毒载体,获得稳定下调 CIB1表达的慢病毒。方法根据 CIB1的序列,设计 siRNA 序列,克隆入慢病毒核心质粒 pGV112中,并与辅助质粒一起转染293T 细胞进行病毒包装,用慢病毒感染293T 细胞并测定病毒滴度。以 CIB1干扰慢病毒感染人胶质瘤细胞 SHG44后,应用 Western blotting 方法检测 CIB1的表达。结果成功构建 CIB1干扰慢病毒载体,包装后获得慢病毒颗粒,病毒滴度检测可达6×108 pfu/ ml,感染细胞 CIB1蛋白表达水平显著下调(P <0.01)。结论成功构建人CIB1 基因RNA 干扰慢病毒,为后续CIB1 生物学功能研究奠定基础。
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CIB1下调表达对U87胶质瘤细胞增殖和细胞周期的影响
目的 探讨钙整合素结合蛋白1(CIB1)下调表达对U87胶质瘤细胞增殖和周期调节的作用.方法 体外培养U87胶质瘤细胞,通过感染携带siCIB的pGV-siCIB1慢病毒获得CIB1下调表达的U87胶质瘤细胞,将细胞分为pGV-siCIB感染组、对照慢病毒感染组和对照组,采用甲基噻唑基四唑检测细胞增殖情况,流式细胞术检测各组细胞凋亡和细胞周期的改变,定量反转录聚合酶链反应、蛋白免疫印迹法检测U87胶质瘤细胞相关基因和蛋白表达情况.结果pGV-siCIB1感染U87细胞的适感染复数值为5.siCIB1感染组CIB1 mRNA和蛋白表达低于对照慢病毒感染组和对照组(P<0.05).pGV-siCIB1感染组FOXO1、MDM2 mRNA及CyclinD1、Bcl-2 mRNA和蛋白、p-AKT蛋白表达水平低于对照慢病毒感染组,而Bax、p53、Caspase3 mRNA和蛋白表达水平高于对照慢病毒感染组(P<0.05,P<0.01).pGV-siCIB1感染组U87胶质瘤细胞抑制率、凋亡率与对照慢病毒感染组相比显著增加,与对照组和对照慢病毒感染组相比,G0/G1期细胞增加,S期细胞减少(P<0.05).结论 CIB1下调表达抑制胶质母细胞瘤的生长,促进细胞凋亡. AKT信号通路可能是CIB1发挥作用的途径之一,提示CIB1有可能作为胶质瘤靶向治疗的靶点.
