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Gibson Assembly系统构建双标签原核类泛素蛋白表达载体
目的 体外构建表达原核类泛素蛋白(prokaryotic ubiquitin-like protein,Pup)的载体是研究Pup化靶蛋白的重要基础,为了提高蛋白纯化的效能和特异性需要构建带组氨酸(his6)和链霉素(strep)标签的Pup蛋白表达载体,为后续研究Pup-蛋白酶体在分枝杆菌中的应激调控奠定基础.方法 设计合成his6-strep片段,扩增富集his6-strep片段,从结核分枝杆菌 H37Rv基因组扩增Pup片段;应用Gibson Assembly系统采用同源片段重组方法将his6-strep片段和Pup片段依次连接到载体上,构建带双标签的原核表达载体 pET28a-his6-strep-Pup 和大肠肝菌-结核杆菌穿梭质粒pM V261-his6-strep-Pup表达载体,经酶切和聚合酶链反应验证,分别导入大肠杆菌(E.coli)和耻垢分枝杆菌(M.sm)中,鉴定和测序获得正确单克隆菌株.培养富集菌株,超声破碎离心收集上清和沉淀,进行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)电泳,用免疫印迹法(Western blot)验证标签蛋白在E.coli和M.sm中的表达.结果 经聚合酶链反应鉴定及测序,证实成功构建了双标签Pup表达载体并导入目的菌株,诱导后蛋白表达,Western blot结果表明标签蛋白在E.coli和M.sm中均可得到正确表达,在M.sm中可发现多种靶蛋白被Pup化结合.结论 快速高效地构建了表达his6-strep-Pup蛋白的双标签重组载体,可以应用于后续 Pup的表达纯化及 Pup化蛋白的功能分析,为进一步开展对Pup-蛋白酶体在分枝杆菌应激调控中的功能研究打下了良好的基础.
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不同标签辅助的IBTX原核表达纯化及活性鉴定
目的:在原核体系中建立高效表达纯化IBTX(Iberiotoxin)的工艺,并比较不同标签对IBTX生物活性的影响.方法:利用引物搭桥的方法,经PCR扩增,获得IBTX编码基因,以此为模板分别构建了表达质粒PET32a(+)-IBTX、pGex-6p-1-IBTX、pDuet-MBP-IBTX,并将其转入E.coli (BL21)分别表达带有硫氧还原蛋白(TRX)、谷胱甘肽巯基转移酶(GST)、麦芽糖结合蛋白(MBP)标签的IBTX融合蛋白,在经过亲和层析、烟草蚀纹病毒(TEV)蛋白酶酶切、C18反向层析纯化后真空冻干得到IBTX干粉,以电生理实验检测其生物活性.结果:在三种标签帮助下通过原核体系表达出的IBTX都能够特异性的阻断大电导Ca2+激活的钾通道(BK)电流,其中MBP帮助折叠的m-IBTX活性佳.结论:建立了IBTX在MBP标签帮助下的原核表达纯化工艺,为进一步研究蝎钾离子通道α家族神经毒素及其突变体的原核表达奠定了基础.
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抗3种标签蛋白单克隆抗体的制备及特性鉴定
目的: 制备并鉴定抗GST、His×6及FLAG的单克隆抗体(mAb).方法: 分别以含GST、 His×6及FLAG标签的融合蛋白为抗原免疫BALB/c小鼠,通过细胞融合制备抗相应标签蛋白的mAb.用Western blot检测mAb对变性融合蛋白的反应性.用流式细胞术(FCM)检测抗FLAGmAb对细胞膜表面融合蛋白的反应性.结果: 共获得12株可稳定分泌抗3种标签蛋白mAb的杂交瘤细胞(其中5株可分泌抗GST mAb,5株可分泌抗His×6 mAb,2株可分泌抗FLAG mAb).11株mAb均可用于相应融合蛋白的Western blot检测.1株抗FLAGmAb检测细胞膜表面融合蛋白的阳性率,与商品化的mAb M2相接近.用1株抗His×6 mAb制备亲和层析柱,并用于纯化IL-8-His融合蛋白,也获得较满意的结果.结论: 成功地制备了抗GST、抗His×6及抗FLAG的mAb,为含标签的融合蛋白的研究和应用提供了重要的工具.
