首页 > 文献资料
-
Gibson Assembly系统构建双标签原核类泛素蛋白表达载体
目的 体外构建表达原核类泛素蛋白(prokaryotic ubiquitin-like protein,Pup)的载体是研究Pup化靶蛋白的重要基础,为了提高蛋白纯化的效能和特异性需要构建带组氨酸(his6)和链霉素(strep)标签的Pup蛋白表达载体,为后续研究Pup-蛋白酶体在分枝杆菌中的应激调控奠定基础.方法 设计合成his6-strep片段,扩增富集his6-strep片段,从结核分枝杆菌 H37Rv基因组扩增Pup片段;应用Gibson Assembly系统采用同源片段重组方法将his6-strep片段和Pup片段依次连接到载体上,构建带双标签的原核表达载体 pET28a-his6-strep-Pup 和大肠肝菌-结核杆菌穿梭质粒pM V261-his6-strep-Pup表达载体,经酶切和聚合酶链反应验证,分别导入大肠杆菌(E.coli)和耻垢分枝杆菌(M.sm)中,鉴定和测序获得正确单克隆菌株.培养富集菌株,超声破碎离心收集上清和沉淀,进行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)电泳,用免疫印迹法(Western blot)验证标签蛋白在E.coli和M.sm中的表达.结果 经聚合酶链反应鉴定及测序,证实成功构建了双标签Pup表达载体并导入目的菌株,诱导后蛋白表达,Western blot结果表明标签蛋白在E.coli和M.sm中均可得到正确表达,在M.sm中可发现多种靶蛋白被Pup化结合.结论 快速高效地构建了表达his6-strep-Pup蛋白的双标签重组载体,可以应用于后续 Pup的表达纯化及 Pup化蛋白的功能分析,为进一步开展对Pup-蛋白酶体在分枝杆菌应激调控中的功能研究打下了良好的基础.
