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Survivin shRNA-APC双基因共表达稳转株对HT-29结肠癌细胞裸鼠皮下移植瘤组织新生血管形成的影响
目的 探讨Survivin shRNA-APC双基因共表达稳转株对HT-29结肠癌细胞裸鼠皮下移植瘤组织细胞中血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)、环氧合酶2(cyclooxygenase-2,COX-2)表达情况及新生血管形成的影响.方法 采用随机数字表法将40只裸鼠分成5组,分别为阴性对照组、空载组、Survivin shRNA组、APC组、Survivin shRNA-APC双基因组.阴性对照组:接种HT-29细胞,空载组:接种空载稳转株,Survivin shRNA组:Survivin shRNA稳转株,APC组:接种APC稳转株,Survivin shRNA-APC双基因组:接种Survivin shRNA-APC双基因组共表达稳转株.将各组稳转株及HT-29结肠癌细胞进行培养,磷酸盐缓冲液(phosphate buffer saline,PBS)重悬使细胞密度达到2×107/ml,每只裸鼠右前腋下分别接种相对应的细胞悬液,构建裸鼠皮下移植瘤模型.待接种6周后统一处死所有裸鼠,剥离移植瘤,分别应用Real time PCR及免疫组化方法检测各组移植瘤组织细胞中VEGF、COX-2mRNA及蛋白表达水平,选取CD34抗体标记血管内皮细胞,应用免疫组化方法测定移植瘤组织微血管密度(MVD).结果 每只裸鼠皮下均形成肿瘤.VEGF及COX-2mRNA表达相对含量SurvivinshRNA组[(50.84±3.64)％、(50.11±3.91)％]、APC组[(74.28±6.87)％、(72.39±6.55)％]、Survivin shRNA-APC双基因组[(21.78±4.00)％、(20.74±5.12)％]较空载组[(100.00±0.00)％、(100.00±0.00)％]、阴性对照组[(98.22±0.38)％、(97.61±0.77)％]明显降低,差异均有统计学意义(P均＜0.05);且Survivin shRNA-APC双基因组中VEGF、COX-2 mRNA表达相对含量较Survivin shRNA组、APC组亦明显降低,差异有统计学意义(P均＜0.05).VEGF、COX-2蛋白表达量Survivin shRNA组(5.15±1.02、5.26±0.91)、APC组(4.96土1.12、4.93± 1.18)、Survivin shRNA-APC双基因组(1.86±0.84,1.80±0.81)较阴性对照组(8.95±0.55、8.77±0.60)和空载组(9.17±0.49、9.01±0.80)明显降低,差异均有统计学意义(P均＜0.05);且Survivin shRNA-APC双基因组中VEGF、COX-2蛋白表达量较Survivin shRNA组、APC组亦明显降低,差异均有统计学意义(P均＜0.05).Survivin shRNA组(12.14±3.45)、APC组(11.39±2.94)、Survivin shRNA-APC双基因组(3.96±2.20) MVD值较阴性对照组(25.09±5.59)和空载组(27.87±7.36)明显降低,差异均有统计学意义(P均＜0.05);Survivin shRNA-APC双基因组MVD值较Survivin shRNA组、APC组亦显著降低,差异均有统计学意义(P均＜0.05).结论 Survivin shRNA-APC双基因共表达稳转株能明显下调移植瘤组织细胞中VEGF、COX-2 mRNA及蛋白表达水平,进而有效抑制移植瘤组织新生血管形成,并且其抑制效果较Survivin shRNA及APC单基因稳转株更为显著.
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Survivin shRNA-APC双基因对结肠癌线粒体凋亡通路相关因子表达的影响
目的 RNA干扰技术对线粒体凋亡通路的影响研究甚少.文中旨在探讨Survivin shRNA-APC双基因对结肠癌线粒体凋亡通路相关因子Survivin、细胞色素C(Cytc)、第二线粒体来源的Caspase激活剂(Smac)、半胱氨酸蛋白酶9( Caspase-9)表达的影响及对结肠癌移植瘤细胞凋亡的影响. 方法 实验用30只裸鼠用随机数字表法分为双基因组、Survivin shRNA组、APC组、空载组和空白组5组,每组6只,将构建好的Survivin shRNA-APC双基因结肠癌细胞稳转株、Survivin shRNA结肠癌细胞稳转株、APC结肠癌细胞稳转株、空载结肠癌细胞稳转株及HT-29结肠癌细胞分别皮下注射至裸鼠左前腋窝中后部,建立裸鼠结肠癌移植瘤模型;检测裸鼠移植瘤体积、瘤重计算生长抑制率;Real time PCR检测移植瘤组织Survivin、Cytc、Smac、Caspase9 mRNA的表达;免疫组化检测移植瘤组织Survivin、Cytc、Smac、Caspase9蛋白的表达;TUNEL检测各组移植瘤组织细胞凋亡情况. 结果 成功构建裸鼠结肠癌移植瘤模型. APC组、Survivin shRNA组、双基因组与空白组和空载组相比,移植瘤组织平均体积、平均瘤重均明显减少(P<0.05),体积抑制率、瘤重抑制率明显升高(P<0.05);与 Survivin shRNA组、APC 组相比,双基因组移植瘤组织平均体积、平均质量均明显减少(P<0.05),体积抑制率、瘤重抑制率明显升高(P<0.05). APC 组、Survivin shRNA 组、双基因组与空白组和空载组相比,移植瘤组织Survivin mRNA及蛋白相对表达量明显降低(P<0.05),移植瘤组织Cytc、Smac、Caspase-9 mRNA及蛋白相对表达量明显升高(P<0.05);与Survivin shRNA组、APC 组相比,双基因组移植瘤组织Survivin mRNA及蛋白相对表达量明显降低(P<0.05),Cytc、Smac、Caspase9 mRNA及蛋白相对表达量明显升高(P<0.05).与空白组和空载组移植瘤组织细胞凋亡指数[(9.87±0.30)%、(10.05±0.42)%]相比,APC 组、Survivin shRNA 组、双基因组[(30.16±1.72)%、(33.61±2.02)%、(56.78±3.04)%]明显升高(P<0.05),其中双基因组移植瘤组织细胞凋亡指数明显高于APC 组、Survivin shRNA 组(P<0.05). 结论 Survivin shRNA-APC双基因可能通过下调线粒体凋亡通路凋亡抑制因子Survivin及上调促凋亡因子Cytc、Smac、Caspase9的表达诱导结肠癌移植瘤组织细胞凋亡,抑制结肠癌移植瘤生长,并且其调节凋亡因子、诱导细胞凋亡及抑制移植瘤生长的能力较单基因更为明显.
