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NaHS对ATP诱导大鼠小胶质细胞P2X受体表达的影响
目的:观察硫化氢(H2S)供体硫氢化钠(NaHS)对ATP致伤的大鼠小胶质细胞细胞活力、细胞膜通透性及P2X7受体表达的影响.方法:实验取对数期形态结构及生长分化良好的大鼠小胶质细胞,随机分4组,每组设3个复孔.①正常对照组:常规培养,不进行ATP处理.②ATP组:接种细胞24h后ATP处理.③NaHS+ ATP组:NaHS预先孵育30 min后再用ATP处理,并且NaHS始终存在于反应体系中.④KN-62(P2X7受体阻断剂)+ATP组:KN-62预先孵育30 min,其余同NaHS+ ATP组.MTT检测各组细胞活力,荧光染料YO-PRO-1检测各组相对荧光单位(RFU)反映膜的通透性,Western blot检测各组P2X7受体表达水平.结果:①与对照组相比,不同浓度的ATP(1、3、5、10 mmol/L)作用3h均可明显降低大鼠小胶质细胞活力,NaHS(200 μmol/L)干预后大鼠小胶质细胞活力较ATP组明显增加(P＜0.01),但NaHS达400 μmol/L浓度时,其保护作用未进一步增加.②随着ATP浓度的增加,大鼠小胶质细胞内YO-PRO-1的荧光强度显著增加,NaHS预处理可明显减少细胞对YO-PRO-1的摄取(P＜0.01).③ATP(3 mmol/L)能上调P2X7受体蛋白表达水平,而NaHS(200 μmol/L)预孵育则可明显抑制ATP引起的P2X7受体蛋白表达的上调(P＜0.01).结论:NaHS可减少ATP致伤的大鼠小胶质细胞的P2X7受体表达、降低通透性、增加细胞活力,提示调控P2X7受体的表达和功能可能是H2S神经保护作用的重要环节.
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P2X7R拮抗剂对小鼠慢性胰腺炎的作用及机制研究
目的：探讨嘌呤能P2X7受体（P2X7R）拮抗剂——氧化三磷酸腺苷（OxATP）和亮蓝G（BBG）在抑制下游靶蛋白——核苷酸结合寡聚化结构域样受体3（NLRP3）炎性体活化和慢性胰腺炎（CP）胰腺纤维化进程中的作用及可能机制。方法40只C57BL/6小鼠随机均分为正常对照组、CP模型组、OxATP组和BBG组。除正常对照组腹腔注射与处理组等体积的生理盐水外，其余组均通过腹腔注射雨蛙素法制作CP小鼠模型（6周）。造模结束后，CP模型组、OxATP组和BBG组分别予以腹腔注射生理盐水、OxATP（20μL，300μmol/L）和BBG（20μL，10μmol/L）处理，连续注射2周。然后处死各组小鼠并取胰腺组织，行病理学检查，以HE染色对胰腺病理组织学（炎性细胞浸润、腺泡萎缩及纤维化程度）进行评分，天狼星红染色和α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）免疫组化染色分别对胰腺纤维化程度进行评估；免疫组化法检测胰腺P2X7R、NLRP3和半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶1（Caspase-1）中的累积光密度（IOD）值。结果与正常对照组比，CP模型组炎症损伤组织学评分增加，胰腺纤维化程度显著增加，P2X7R、NLRP3和Caspase-1免疫组化IOD值显著升高（P<0.05）；与CP模型组相比，OxATP和BBG组炎症损伤组织学评分降低，HE染色纤维化评分、天狼星红染色和α-SMA免疫组化染色均显著减轻（P<0.05），胰腺P2X7R、NLRP3和Caspase-1 IOD值均明显降低（P<0.05）。结论 P2X7R拮抗剂OxATP 和BBG能够显著减轻CP小鼠模型的慢性炎症和纤维化程度，阻断P2X7R-NLRP3炎性体信号通路，这有望成为治疗CP及其纤维化进程的一种潜在新策略。
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外源性三磷酸腺苷对高表达P2X7受体的宫颈癌Caski细胞生长的影响
目的:探讨外源性三磷酸腺苷(ATP)对高表达P2X7受体的人宫颈癌Caski细胞(Caski-P2X7)生长及凋亡的影响,为临床应用提供理论依据.方法:选择本实验室建立的Caski-P2X7细胞和对照Caski-3.1细胞(转染空载体质粒),用不同浓度ATP分别处理两种细胞株,MTT法检测细胞生存率,荧光染色法检测线粒体膜电位,流式细胞术检测细胞凋亡率；用2.5mmol/L ATP处理两种细胞后,Western blot检测凋亡相关蛋白(细胞色素C,bcl-2,Bax)的变化.结果:不同浓度ATP作用后,两种细胞生存率及线粒体膜电位均降低,而细胞凋亡率升高,均呈浓度依赖性;同一浓度ATP作用后,Caski-P2X7细胞生存率及线粒体膜电位均显著低于Caski-3.1细胞(P＜0.05),但细胞凋亡率显著高于Caski-3.1细胞(P＜0.05).2.5mmol/L ATP处理后,Caski-P2X7细胞胞质中细胞色素C及凋亡蛋白Bax表达量明显增加(P＜0.05),而抗凋亡蛋白bcl-2表达量明显减少(P＜0.05).结论:一定浓度的ATP可通过P2X7受体途径诱导宫颈癌Caski细胞凋亡.
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亮蓝G减轻急性CO中毒大鼠海马的损伤
目的:观察亮蓝G(BBG)对急性一氧化碳中毒(ACMP)引起的大鼠海马组织损伤的影响,探讨配体门控离子通道嘌呤能P2X7受体(P2X7R)在一氧化碳中毒脑损伤中的作用.方法:80只8～10周龄SD大鼠分为对照(control)组、ACMP组、ACMP+BBG组和BBG组.采用腹腔注射CO(100 mL/kg)的方法制备大鼠ACMP模型.检测静脉血中的碳氧血红蛋白(HbCO)浓度来判断CO中毒程度.RT-qPCR检测大鼠海马组织P2X7R的mR-NA表达.干湿称重法检测海马组织水肿程度.ELISA法检测海马组织促炎因子白细胞介素1β(IL-1β)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)和IL-6的含量.Morris水迷宫实验评价学习记忆能力.HE染色观察海马CA1区细胞形态学改变.结果:与control组(100％)相比,染毒6 h后ACMP组大鼠的存活率降低至55％;海马组织P2X7 R的mRNA表达及促炎因子IL-1β、TNF-α和IL-6的含量均明显增加(P<0.05);含水量升高到80.72％±0.93％;大鼠逃避潜伏期明显延长,在目标象限探索时间明显缩短.值得注意的是,BBG预处理可以明显改善ACMP诱导的这些海马损伤.另外,大鼠染毒后3 d,海马CA1区的神经元排列紊乱稀疏,细胞形态不完整,细胞核深染、固缩.而BBG预处理能够显著改善CA1区的细胞形态.结论:P2X7 R与ACMP诱导的海马损伤相关.BBG能够增加ACMP大鼠的存活率,减少促炎因子的释放,减轻海马水肿,改善学习记忆能力,减轻ACMP引起的CA1区神经元损伤.
