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二硫键稳定的双特异diabody的构建及表达
目的:在双特异diabody中设计和引入二硫键结构,提高其稳定性.方法:在抗HBsAg/RBC双特异diabody表达载体中分别将抗HBsAg或抗RBC抗体的轻重链可变区基因适当部位进行突变,引入半胱氨酸残基,使diabody结构中形成共价键.大肠杆菌中分泌表达或包含体表达.结果:使抗HBsAg/RBC双特异diabody的热稳定性和在尿素中的稳定性得到了较大程度的提高,改善了diabody的性能.结论:证明了diabody二硫键模型的可行性.
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抗地高辛人源小分子抗体的构建
目的:将从大容量噬菌体抗体库中筛选得到的人源抗地高辛单链抗体进行分泌表达,并构建Diabody(双体抗体).方法:将抗地高辛的噬菌体抗体转染HB2151菌(无琥珀抑制基因的宿主菌),IPTG诱导,制备抗地高辛的可溶性单链抗体.选取活性较好的克隆进行基因改造,构建Diabody表达载体,并分泌表达,表达Diabody进行Western blot鉴定.结果:经ELISA结合活性测定,得到了结合活性较高的抗地高辛的可溶性单链抗体;基因改造后,经ELISA及Western blot测定证实获得了结合活性较好的抗地高辛Diabody.结论:实验获得了分泌表达活性可靠的人源性抗地高辛抗体,并改造成应用前景较好的Diabody,为临床诊断及治疗洋地黄类药物中毒提供具有实用价值的人源小分子抗体.
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二硫键稳定的抗CD3/抗CD19微型双功能抗体的表达及活性测定
构建了抗CD3/抗CD19(Diabody)微型双功能抗体,并且为增强其稳定性进一步改造为二硫键稳定的抗CD3/抗CD19(ds-Diabody)微型双功能抗体,表达并纯化后测定其生物学活性.构建二硫键稳定的抗CD3/抗CD19表达载体pAYZdsCD3CD19,转化感受态大肠杆菌16C9进行原核表达,分离纯化后,经12％ SDS-PAGE及Westen-blot鉴定.应用间接免疫荧光和竞争性免疫荧光结合流式细胞分析技术(FACS)检测ds-Diabody与CD19+ Raji细胞和CD3+ Jurkat细胞的结合活性.改造后的ds-Diabody能够在原核表达系统中进行可溶性表达,ds-Diabody在非还原性SDS-PAGE中,在45 k处可见一条带,Westen-blot在同一位置显示有带,在还原性SDS-PAGE中45 k处条带消失,在28 k和26 k各有一条带,Western-blot在28 k显示有带,这些均与理论相符,45 k为二硫键稳定的二聚体,在还原剂巯基乙醇作用下二硫键断开,形成28 k和26 k的2条带.FACS检测ds-Diabody可与CD19+ Raji细胞和CD3+ Jurkat细胞特异结合,并能竞争性抑制单抗HIT3a和HIT19a与上述细胞的结合.说明改造后的二硫键稳定的抗CD3/抗CD19双功能抗体既能在原核系统中进行可溶性表达,同时又保留了与细胞的结合活性.
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去除Etag标记的抗CD3/抗Pgp微型双功能抗体原核表达载体的构建及表达
目的:构建和表达不带Etag标记的抗CD3/抗Pgp微型双功能抗体(Diabody[CD3×Pgp]),并测定其生物学活性.方法:利用PCR方法构建不带Etag的Diabody[CD3×Pgp]原核表达载体,进行原核表达,制备抗抗CD3 scFv亲和层析柱进行纯化,SDS-PAGE鉴定.通过间接免疫荧光法和竞争性免疫荧光结合流式细胞术(FCM)检测生物学活性.结果:无Etag的Diabody[CD3×PgP]表达载体经测序证实其序列正确.SDS-PAGE电泳显示2条带,相对分子质量(Mr)分别为25 000和26 000,与预期Mr相符.去除Etag的Diabody[CD3×Pgp]与K562/A02和Jurkat细胞结合阳性率分别为89.87%和83.95%.竞争结合实验中,与K562/A02和Jurkat细胞竞争后结合率分别为50.25%和43.78%.结论:成功构建了不带Etag的Diabody[CD3×Pgp]表达载体、进行原核表达及纯化.不带Etag的Diabody[CD3×Pgp]能特异性结合CD3和PgP靶抗原,Etag标记去除后其生物学活性没有降低.
